人体外周血CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞体外扩增的实验研究

王新梅，王雪野，韩 梅*，肖中平

(吉林省人民医院 1.血液科;2.肿瘤科，吉林 长春130021)

人体外周血CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞体外扩增的实验研究

王新梅1，王雪野2，韩 梅1*，肖中平1

(吉林省人民医院 1.血液科;2.肿瘤科，吉林 长春130021)

目的探讨人体外周血CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞(DNT细胞)在体外进行分离和扩增的方法。方法取健康的成人外周血20 ml，应用Rosettesep抗体吸附法去除CD4+T细胞和CD8+T细胞；再将DNT细胞放入anti-CD3mAb包被的培养板中，并加入rhIL-2、rhIL-4，共同培养，第10天和第14天计数细胞扩增倍数及记录扩增曲线；利用Easysep免疫磁珠法纯化，采用流式细胞仪检测其纯度。结果经分选、纯化后的DNT细胞，纯度可达94%以上；体外培养第10天和第14天，DNT细胞扩增倍数分别为53倍和41倍。结论通过Rosettesep抗体吸附法及Easysep免疫磁珠法分离及纯化DNT细胞是可行的，可获得大量高纯度的DNT细胞。

CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞；Rosettesep抗体吸附法；Easysep免疫磁珠法；流式细胞术

(ChinJLabDiagn,2017,21:1831)

免疫调节性T细胞是人体免疫系统产生免疫耐受的重要机制，近年来由于免疫学和分子生物学技术的飞速发展，免疫调节性T细胞越来越受到人们的关注，研究发现这类细胞在机体的自身免疫、肿瘤免疫以及器官移植等方面都具有重要的作用。目前被证实的具有调节免疫应答功能的细胞主要包括：免疫抑制性CD8+CD28-T细胞、γδTCR+T细胞、自然杀伤(NK) T细胞、CD8+否决细胞以及CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞(double negative T cells，DNT细胞)[1]。其中DNT细胞具有独特的生物学功能，主要与其表面标志不同及分泌特殊的效应因子有关[2,3]。然而，DNT细胞在正常人和小鼠的外周血T淋巴细胞中的数量极少，仅占1%-2%和1%-5%[4-6]，这就限制了对其功能的进一步研究。因此，对于DNT细胞的体外扩增方法及优化，成为目前亟待解决的问题。本课题研究的目的为体外分离和培养外周血DNT细胞，获取一定数量高纯度的DNT细胞，为进一步研究其作用机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1标本来源

每年进行健康体检志愿者5名，其中男2名，女3名，年龄21-44岁，中位年龄33岁。于清晨、空腹、采集肝素抗凝静脉血20 ml。

1.2试剂和仪器

抗-CD3 单抗购自美国eBioscience公司；rh IL-2，rh IL-4购自美国PEPROTECH公司；Rosettesep CD4、CD8负选试剂盒、Easysep CD4、CD8、CD56正选试剂盒、磁极均购自于加拿大STEMCELL公司；淋巴细胞分离液购自达科为生物技术有限公司；CD3-PC5/ CD4-FITC /CD8-PE，CD3-FITC/CD56-PE，流式细胞仪(EPICS XL)均产自于美国贝克曼-库尔特公司；5 ml聚苯乙烯试管，购自于美国BD公司；多标记微孔板分析仪1420，购自美国PerkinElmer Victor公司。

1.3实验方法

1.3.1Rosettesep抗体吸附法分离DNT细胞 新鲜肝素抗凝静脉血20 ml，加入Rosettesep Human CD4和 CD8 Depletion Cocktail各 50 μl/mL，在室温条件下，孵育20 min；加入PBS+2%FBS 10 ml；加入到15 ml Ficoll中，于2 300 rpm离心30 min。取上、中层交界的白色云雾状液体层，再加入PBS+2%FBS稀释，于1 200 rpm离心10 min，弃上清，重复2次。计数细胞，以细胞培养液调整细胞浓度为1.0×106/mL。

1.3.2DNT细胞的体外培养 准备24孔板，用anti-CD3mAb 100 ng/mL包被，封口膜封口，孵箱过夜。以适量PBS+2%FBS洗板3次，分别加入RPMI-1640，10% FBS，链霉素100 μg/mL，青霉素100 U/mL，rhIL-2 50 U/mL，rhIL-4 30 U/mL。将细胞浓度调整为1×106个/mL的DNT细胞加入24孔板，每孔加2 ml。每3天换液1次。共培养10-14天。

1.3.3DNT细胞的纯化 收集24孔板中细胞，计数细胞并调整细胞浓度为1×108个/mL，放入聚苯乙烯试管中，加入Easysep Human CD4 Positive Selection Cocktail 、Easysep Human CD8 Positive Selection Cocktail、 Easysep Human CD56 Positive Selection Cocktail 各100 μl/mL，在室温条件下进行孵育，15 min，再于聚苯乙烯试管中分别加入磁珠50 μl/mL，混匀，室温避光，孵育10 min，再加入Robosep Buffer，至总体积为2.5 ml，放入磁极中5 min，将所需要的DNT细胞倒入新的试管中，重复3次，加入2 ml Robosep Buffer，1 200 rpm，离心10 min。

1.3.4免疫荧光染色及流式细胞仪检测 取细胞悬液100 μl，分别加入CD3-PC5/CD4-FITC /CD8-PE，CD3-FITC /CD56-PE各20 μl，室温避光孵育15 min，加入冷PBS洗涤，1 500 rpm离心，10 min，弃上清，加入0.5 ml的PBS，混匀。采用EPICS-XLII流式细胞仪进行检测，收集细胞数5×106个/管。上机前对流式细胞仪进行光流路质量调控，双色荧光补偿，Listmode形式保存文件，应用CellQuest软件分析结果。

2 结果

2.1DNT细胞的体外培养

细胞培养第7、10、14天，镜下可见培养板底大量圆形核深染细胞，细胞数量及克隆现象逐渐增多，第10天达高峰，第14天可见细胞凋亡现象。

2.2DNT细胞的流式细胞仪检测结果

采用Rosettesep抗体吸附法分离DNT细胞，流式细胞仪检测CD3+CD4-CD8-T细胞比例为94.4%(图1)。体外扩增及Easysep免疫磁珠法纯化后的CD3+CD4-CD8-T细胞纯度可达99.2%(图 2)。

2.3DNT细胞的体外扩增

将细胞培养至d7，d10，d14，计算扩增倍数。结果显示细胞培养至d10生长最旺盛，延长培养时间，细胞数逐渐减少。第0天，第4天，第7天，第10天，第14天，DNT细胞数分别为8×106个，8×107个，3.12×108个，4.24×108个，3.28×108个。DNT细胞扩增倍数分别为0倍，10倍，39倍，53倍，41倍(图3)。

3 讨论

DNT细胞，是一群既不表达CD4分子，也不表达CD8分子的调节性T细胞，通过抗原特定因子的方式，来抑制免疫应答的发生[7]。大量的研究表明，DNT细胞具有抑制肿瘤生长的作用，有望成为一种新型的肿瘤过继细胞免疫治疗方法。目前，一些免疫学专家认为，能够使调节T细胞活化的刺激因素主要为T细胞受体(TCR)，这种受体对调节性T细胞起刺激性作用，对其功能造成影响。但是，DNT细胞与其他种类的调节性T细胞不同，因其本身不表达共受体CD4和CD8，也不表达共刺激分子CD28[8]。另外，一些专家学者指出，细胞因子等对于DNT细胞的激活和DNT细胞发挥的功能都具有重要的作用[9]。DNT 细胞能够在体外存活，需要有外源性的IL-2和IL-4的参与刺激，同时IL-4也具有保护DNT细胞的作用，避免发生和TCR交叉刺激，从而发生细胞的凋亡[10,11]。有研究者基于体外容易得到的人外周血单个核细胞，用 CD3抗体成功在体外扩增活化T淋巴细胞，并且CD3抗体可增加淋巴细胞转化，并与浓度有关[12]。

图3 DNT细胞体外扩增的生长曲线

在实验研究中我们采用的扩增方法为通过anti-CD3mAb包被培养板，起到了人工APC的作用，能够减少异体APC所带来的各种差异，以及异体免疫细胞的污染，减少因异体排斥反应所引起的增殖减低，加上rhIL-2和rhIL-4，方法简便，有利于大批量扩增及应用。但此种方法受限于不能长期培养，在培养14天左右细胞数就逐渐下降，所以本实验方法有待于进一步改进。Ford Mclntyre等[13]研究发现，同种异体的APC可以有效的激活DNT细胞，使DNT细胞在体外进行扩增，通过穿孔素途径可以引起同种异体或同种同体的B细胞的凋亡。在我们的实验中也同样见到的细胞凋亡现象，考虑与B细胞的凋亡有关。

传统的细胞分选的技术，如流式细胞术，十分昂贵，而且对于DNT细胞的分选费时较多， 从而影响了细胞的活性，不利于细胞的进一步培养及应用。免疫磁珠法分选细胞是通过磁极和包被不同的抗体，可进行几乎所有细胞亚群的分离和纯化，不仅简便灵活，而且经济省时，并且对于细胞造成的损伤也小，有利于分离后的培养和应用。本实验采用Rosettesep抗体吸附法和Easysep免疫磁珠法获得的DNT细胞，纯度大于94%，可保证对于DNT细胞体外培养扩增以及对DNT细胞抗肿瘤等作用研究的实验要求。

通过本研究得到的纯度高并且数量多的DNT细胞，使接下来研究DNT细胞发挥免疫调节功能和对肿瘤的抑制作用的分子机制奠定了理论基础。

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AmplificationofHumanperipheralbloodCD3+CD4-CD8-doublenegativeTcellsinvitro

WANGXin-mei,WANGXue-ye,HANMei.

(HematolgyDepartmentofJilinProvincePeople’sHospitalChangchun130021,China)

ObjectiveTo detect the method of isolation and amplification CD3+CD4-CD8-double negative T cells (DNT) in vitro.MethodsWe used the Rosettesep to remove CD4+T cells and CD8+T cells from human peripheral blood.To culture DNT cells with anti-CD3mAb,rhIL-2 and rhIL-4.We computed and recordedthe amplification times after day 10 and day 14.To putify DNT cells with Easysep and test its purity with flow cytometry.ResultsThe purity of DNT cells is 94%.The amplification times is 53 in day 10 and 41 in day 14.ConclusionThe method of Rosettesep and Easysep can be used to isolate and purify DNT cells.

CD3+CD4-CD8-double negative T cells;Rosettesep antibody adsorption method;Easysep micro-magnetic beads method;Flow cytometry

R446.62

A

2016-12-09)

吉林省卫生厅项目(2012Z052)，吉林省科技厅项目(20150204074SF)

*通讯作者

1007-4287(2017)10-1831-04

王新梅(1983-)，女，医学硕士，医师，主要从事血液病基础相关研究。