X线辐射对A549肺腺癌细胞周期和增殖的影响

王 溪，佟志敏，胡媛媛，金 鹏，李 宁，李诗扬，崔营营,张红梅

(1.吉林大学第二医院 放疗科，吉林 长春130041；2.吉林省申邦细胞工程研究所;3.吉林大学中日联谊医院)

X线辐射对A549肺腺癌细胞周期和增殖的影响

王 溪1，佟志敏2，胡媛媛1，金 鹏1，李 宁1，李诗扬1，崔营营1,张红梅3*

(1.吉林大学第二医院 放疗科，吉林 长春130041；2.吉林省申邦细胞工程研究所;3.吉林大学中日联谊医院)

目的探讨X线不同放射剂量对A549肺腺癌细胞周期和增殖的影响。方法培养A549肺腺癌细胞，分别用0Gy、0.5Gy、1Gy、1.5Gy、2GyX线照射细胞，并继续培养6 h和12 h后收集细胞，用PI法检测细胞周期，CCK8法检测细胞增殖。结果G2期细胞6 h检测结果显示，与0Gy组相比，各剂量组G2期细胞比例均显著增加(P<0.001)，与0.5Gy、1Gy、1.5Gy相比，2Gy组G2期细胞比例也显著增加(P<0.05)；12 h检测结果显示，1Gy、1.5Gy、2Gy组G2期细胞比例均高于0Gy、0.5Gy组(P<0.05)；1.5Gy、2Gy组G2期细胞比例高于1Gy组。S期细胞6 h检测结果显示，各剂量组S期细胞比例均高于0Gy组(P<0.05)，但各剂量组之间无明显差异；12 h检测结果显示，各剂量S期细胞比例随辐射剂量增加而增加，除0Gy组与0.5Gy组、0.5Gy组与2Gy组外均具有统计学意义(P<0.05)。6h CCK8结果显示，与0Gy、0.5Gy组相比2Gy组细胞增殖能力显著减弱(P<0.05)。12 h CCK8结果显示，与0Gy、0.5Gy组相比，1Gy、1.5Gy、2Gy组细胞增殖能力显著减弱(P<0.05)。结论辐射能够诱导细胞周期阻滞从而抑制细胞增殖，且在一定剂量范围内呈剂量依赖性。

辐射；细胞周期；增殖

(ChinJLabDiagn,2017,21:1816)

最新统计数据显示，肺癌发病率与死亡率分居世界第二位、第一位[1]，目前肺癌的主要治疗方法有化疗、放疗、靶向治疗[2]。放疗在肺癌治疗中起重要作用，提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，是提高放射治疗疗效的重要途径之一，其中放疗剂量对肿瘤敏感性起着关键的作用[3,4]。恶性肿瘤细胞的过快增殖是肿瘤发生发展的基础，细胞周期调控异常是恶性肿瘤的一个基本特征，细胞周期异常是肿瘤细胞恶性增殖的中心环节[5-7]，许多抗癌药物是通过改变肿瘤的细胞周期而实现其抑制肿瘤的作用。放射线可以改变肿瘤细胞周期，电离辐射的细胞毒性取决于细胞周期的分布[8,9]。本研究主要探讨了不同X线辐射对A549细胞周期与增殖的影响，为临床制定放疗计划提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1材料肺腺癌A549细胞株购自中国科学院上海细胞库；H-DMEM培养基(GIBCO，美国)；胎牛血清(Biologicallndustries，以色列)；细胞周期与凋亡检测试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司)；细胞增殖与毒性检测试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司)；流式细胞仪EPICS XL(BECKMAN COULTER)；瓦里安直线加速器23 EX(VarianMedicalSystems,Inc)；CO2培养箱(SANYO，日本)；低温高速离心机(Thermo，美国)；酶标仪(Gene，美国)。

1.2A549肺腺癌细胞培养无菌工作台紫外线消毒30 min，将实验用H-DMEM培养液，胎牛血清，胰酶，PBS放于37℃的水浴锅内预热30 min；在离心管中准备9 ml无血清培养液；液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴中轻轻晃动；融化后移至离心管中1 200 rpm离心3 min，小心弃去离心管中上清加入含有10%FBS血清的完全培养基，放于CO2培养箱中培养；培养过夜后更换新鲜的完全培养基。两天传代一次，用PBS洗细胞两次，胰酶消化1 min，用吸管轻轻吹打细胞并将其转移至离心管中，1 200 rpm离心5 min；弃去离心管中上清，加入含有10%血清的完全培养基悬浮细胞，并分至两个培养瓶中，置于37℃培养箱中培养。

1.3分组与照射将细胞消化收集并计数，按每孔2×105/2 ml细胞数接种于六孔培养板中，于37℃CO2培养箱中培养过夜。根据照射后培养时间将细胞分为A(照射后培养6 h)、B(照射后培养12 h)两组，A、B两组根据需要照射剂量的不同又分为5组，分别为0Gy组、0.5Gy组、1Gy组、1.5Gy组、2Gy组。

采用剂量率为300 Mu/min、源皮距为100 cm的6MV-X射线对各组细胞对进行照射，照射后立即换液，然后放入培养箱中培养。

1.4细胞周期检测分别在培养板的每孔中加PBS，轻轻洗涤细胞，再加0.5 ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞，并收集至无菌的1.5 ml EP管中；离心后尽可能弃去EP管中的上清，轻弹管底使管中细胞重悬；按下列比例配制细胞周期缓冲液：1 ml缓冲液、碘化丙啶(PI) 25 μl，RNase A 20 μl。每管分别加入500 μl上述缓冲液；于37℃CO2培养箱中孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.5细胞增殖检测分别在培养板每孔加入10 μl 7sea-Cell Counting kit，以仅加100 μl完全培养液和7sea-Cell Counting kit作为空白对照；于培养箱中继续孵育2 h，用酶标仪检测450 nm处的吸光度值(OD值)。

2 结果

2.1X线不同剂量照射A549肺腺癌细胞后细胞周期的改变

流式细胞检测结果显示，A组细胞各剂量组G2期细胞比例随剂量的增加而增加，差异显著，具有统计学意义(P<0.001)，其中2Gy组与其他各组也具有统计学意义(P<0.05)；B组细胞也显示出G2期细胞比例随剂量增加而增加的趋势(P<0.05)。

A组细胞各剂量组S期比例均高于0Gy组，差异显著(P<0.05)，而各剂量组之间无明显变化。

结果表明X线辐射可以引起A549细胞G2期、S期阻滞，且对G2期细胞阻滞呈剂量依赖性(图1、图2、图3)。

2.2不同剂量放疗对A、B组A549肺腺癌细胞增殖的影响

CCK8法检测A549肺腺癌细胞的增殖情况，A组检测结果显示：与0Gy组相比，各剂量组的OD值均减小，且随着照射剂量的增加，OD值越来越小。统计学分析显示：2Gy组与0Gy、0.5Gy组相比，差异显著(P<0.05)。B组检测结果显示：与0Gy组相比，各剂量组的OD值均减小，且随着照射剂量的增加，OD值越来越小。统计学分析显示：与0Gy、0.5Gy组相比，1Gy、1.5Gy、2Gy组OD值均显著减小(P<0.05)。表明X线辐射可以抑制肺腺癌细胞A549的增殖，且随剂量的增加，抑制作用越明显(图4)。

3 讨论

随着放疗技术在医学研究领域的进展，辐射对肿瘤细胞的杀伤作用越来越受到人们的重视，本研究以A549细胞为对象，探讨了不同辐射剂量对细胞周期和增殖的影响，验证了在一定范围内，随着剂量的增加，X辐射对A549细胞的周期、增殖的抑制作用增强。这为临床实践提供了实验数据。

图1 A、B两组A549肺腺癌细胞不同剂量辐射后细胞周期检测结果

图2 A、B两组细胞照射后G2期的变化

*：0.5、1.0、1.5、2.0Gy组VS 0Gy组P<0.05；#：1.0、1.5、2.0Gy组VS 0.5Gy组P<0.05

*：0.5、1.0、1.5、2.0Gy组VS 0Gy组P<0.05；#：1.0、1.5、2.0Gy组VS 0.5Gy组P<0.05

细胞周期的正常循环是细胞增殖的关键因素，如果细胞停滞在周期中的某一个时期，则无法进行正常的循环，从而影响正常的细胞增殖[10-13]。一般的，肿瘤细胞经X线照射后有G2/M 期的阻滞现象，而且G2/M 期的阻滞现象在一定的X线剂量范围内呈剂量依赖性[9,14]。研究显示，细胞的放射敏感性与细胞周期、氧效应和DNA损伤修复能力等密切相关。处于不同周期的细胞对射线的敏感性不同。通常，M 期和G2 期的细胞对射线最为敏感，G1 期次之，而S期的细胞最不敏感[15,16]。基于以上研究，我们对人肺腺癌A549细胞进行不同剂量的X线照射，发现了X线对A549细胞G2期、S期的抑制作用，而且随辐射剂量增加，G2期细胞增加越明显，呈剂量依赖性。我们分别对辐射后6小时、12小时的细胞进行观察，得到的结论一致，这充分证明了辐射对A549细胞增殖的抑制作用。

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EffectsofX-rayirradiationoncellcycleandproliferationofA549lungadenocarcinomacells

WANGXi,TONGZhi-min,HUYuan-yuan,etal.

(DepartmentofRadiotherapy,SecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveTo investigate the effects of different radiation dosages on cell cycle and proliferation of A549 lung adenocarcinoma.MethodsA549 cells were cultured and then radiation for 0Gy,0.5Gy,1Gy,1.5Gy and 2Gy.The cells were collected after 6h and 12h after irradiation.The cell cycle was detected by PI method,proliferation was detected by CCK8 method.ResultsThe results of 6h showed that compared with 0Gy group,the proportion of G2 phase cells in each dose group was significantly increased (P<0.001).Compared with 0.5Gy,1Gy and 1.5Gy,the ratio of G2 phase cells in 2Gy group was also significantly increased (P<0.05).The results tested in 12 h showed that the ratio of G2 phase cells in 1Gy,1.5Gy and 2Gy groups was higher than that in 0Gy and 0.5Gy group (P<0.05).The ratio of G2 phase cells in 1.5Gy and 2Gy group was higher than that in group 1Gy.The results of 6 h test showed that the proportion of S phase cells in each dose group was higher than that in 0Gy group (P<0.05),but there was no significant difference among the dose groups.The results of 12 h test showed that the proportion of S phase cells ,except for 0Gy group and 0.5Gy group,0.5Gy group and 2Gy group,was increased alone with the increase of dose (P<0.05).The results of 6h CCK8 showed that the proliferation ability of 2Gy group was significantly decreased compared with 0Gy and 0.5Gy group(P<0.05).12 h CCK8 results showed that the cell proliferation ability of 1Gy,1.5Gy,2Gy group was significantly decreased compared with 0Gy and 0.5Gy group(P<0.05).ConclusionRadiation can induce cell cycle arrest and inhibit cell proliferation in a dose-dependent manner.

radiation;cell cycle;proliferation

R734.2

A

2016-11-06)

吉林省科技发展计划项目(20160101104JC)

*通讯作者

1007-4287(2017)10-1816-05