维生素A缺乏干眼病角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达与细胞凋亡的关系研究

丛 越，王万梅

(吉林大学第二医院，1.眼底病科；2.心血管内科，吉林 长春130041)

维生素A缺乏干眼病角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达与细胞凋亡的关系研究

丛 越1，王万梅2

(吉林大学第二医院，1.眼底病科；2.心血管内科，吉林 长春130041)

目的探究维生素A缺乏干眼病角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达与细胞凋亡的关系，为干眼病发病机制的研究提供理论依据。方法5只雄兔维生素A缺乏干眼病模型以及5只正常喂养的雄兔，分别设为观察组与对照组。采用原位末端标记及免疫组织化学方法检测两组试验动物角膜组织上皮细胞的细胞凋亡情况，并检测FasL、Fas、Bax以及bcl-2等相关基因蛋白在角膜上皮细胞中的表达，探讨维生素A缺乏干眼病角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达与细胞凋亡的关系。结果观察组雄兔每高倍镜视野角膜组织上皮细胞凋亡数量为(4.89±1.34)个，对照组为(0.65±0.32)个，差异具有统计学意义(P<0.05)；观察组每1000个角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax阳性表达细胞数量分别为(187.35±23.23)、(212.45±24.55)、(168.67±21.43)个，显著高于对照组(65.23±18.23)、(68.46±14.51)、(48.43±16.46)个，观察组每1000个角膜组织上皮细胞bcl-2阳性表达细胞数量为(54.44±16.34)个，显著低于对照组(217.43±24.13)个，差异有统计学意义(P<0.05)；Fas、FasL、Bax的表达与角膜组织上皮细胞凋亡呈显著正相关(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，bcl-2的表达与角膜组织上皮细胞凋亡呈显著负相关(r=-0.754P=0.000)。结论角膜组织上皮细胞凋亡可能导致角膜组织上皮细胞出现干燥、变薄，引起功能减退，导致干眼病症状，这可能与Fas、FasL、Bax表达量增多，bcl-2的表达量降低加快角膜组织上皮细胞凋亡有关。

维生素A缺乏干眼病；角膜组织上皮细胞；Fas；FasL；Bax；bcl-2；表达；细胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:1820)

干眼病是指各种因素引起的泪液动力学、质或量异常，导致降低泪膜稳定性，并伴有眼表组织病变以及眼部不适等特征的多种疾病的总称，临床上又命名为角结膜干燥症。常见症状有疲倦、干涩、异物感、眼痒、痛灼热感、怕风、分泌物黏稠、畏光、外界刺激敏感等；眼睛干涩，基本泪液不足，出现反射性泪液分泌引起经常流泪，严重者出现眼睛红肿、充血、角质化等，部分可引起角结膜病变，视力受损[1]。传统理论认为上皮完整性受损、坏死脱落是干眼病角膜特征性病理变化。近年国外有报道[2]认为，干眼病患者角膜上皮细胞有向小细胞转化的趋势，病情严重者角膜上皮甚至呈角膜上皮结膜化或鳞状化，而角膜上皮修复及愈合过程能够观察到细胞凋亡的存在，Fas、FasL、Bax和bcl-2等基因的表达与细胞凋亡具有明显的关系。因此本实验通过建立维生素A缺乏的雄兔干眼病模型，探究维生素A缺乏干眼病角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达与细胞凋亡的关系，为干眼病的发病机制的研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

5只雄兔维生素A缺乏干眼病模型，以及5只正常喂养的雄兔，分别设为观察组与对照组。观察组日龄90 d；体重最轻2.45 kg，最重2.57 kg，平均(2.51±0.04)kg；对照组日龄90 d；体重最轻2.49 kg，最重2.65 kg，平均(2.52±0.05)kg；实验兔均为雄性新西兰白兔，由我院动物中心饲养，两组基础饲养完全相同。比较两组日龄，体重等一般资料无显著性差异(P>0.05),具有可比性。

1.2模型建立及标本处理

模型建立：两组基础饲养完全相同，观察组雄兔给予完全缺乏维生素A的饲料，对照组正常饲料，每日维生素A摄入量不低于200 μg/kg。所有动物均由一名工作人员检查，每次检查地点、时间、光照、湿度及温度均保持相同。分别饲养90 d后，观察组毛发较粗糙，角膜无光泽、干燥，有灰白色溃疡灶出现。泪液分泌(schirmer)实验显示观察组均<10 mm/5 min，对照组均>20 mm/5 min。观察组泪膜破裂时间均<12 s，对照组均>24 s，根据文献[3]干眼病的诊断标准确定模型建立成功。标本处理：饲养90 d后两组试验兔均采用空气栓塞法处死，死后立刻取双眼角膜组织且携带1 mm的巩膜环，采用40 g/L的多聚甲醛固定，采用常规石蜡包埋、HE染色。

1.3方法

采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)检测原位细胞凋亡情况，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)购自上海翊圣生物科技有限公司；山羊抗兔Fas、FasL、Bax和bcl-2多抗购自北京索莱宝科技有限公司；过氧化物酶标记链酶白卵素(SABC)免疫组织化学试剂盒购自美国R&D公司；3，3’-二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自上海安妍生物有限公司。标本切片后严格参照试剂盒说明书进行染色，凋亡细胞原位检测阳性对照在滴加反应液前，于1 g/LDNase I溶液进行15 min的室温孵育；阴性对照组仅添加dUTP-FITC。采用乳腺癌石蜡切片处理免疫组织化学染色阳性对照，采用PBS液代替一抗处理阴性对照。细胞凋亡数统计：随机选取两组5-7个400倍的高倍视野中凋亡细胞总数，计算平均值；Fas、FasL、Bax和bcl-2的表达：随机选取1 000个角膜上皮细胞，观察免疫组织化学染色阳性细胞总数。

1.4统计学分析

2 结果

2.1两组角膜组织上皮细胞凋亡数量比较

观察组雄兔每高倍镜视野角膜组织上皮细胞凋亡数量为(4.89±1.34)个，对照组雄兔为(0.65±0.32)个，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组角膜组织上皮细胞凋亡数量比较

2.2两组角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax、bcl-2阳性表达细胞数量比较

观察组每1000个角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax阳性表达细胞数量分别为(187.35±23.23)、(212.45±24.55)、(168.67±21.43)个，显著高于对照组(65.23±18.23)、(68.46±14.51)、(48.43±16.46)个，观察组每1000个角膜组织上皮细胞bcl-2阳性表达细胞数量为(54.44±16.34)个，显著低于对照组(217.43±24.13)个，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组每1000个角膜组织上皮细胞Fas、FasL、Bax、bcl-2阳性表达细胞数量比较

2.3Fas、FasL、Bax、bcl-2的表达与角膜组织上皮细胞凋亡的相关性

Fas、FasL、Bax的表达与角膜组织上皮细胞凋亡呈显著正相关(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，bcl-2的表达与角膜组织上皮细胞凋亡呈显著负相关(r=-0.754P=0.000)，见表3。

表3 Fas、FasL、Bax、bcl-2的表达与角膜组织上皮细胞凋亡的相关性

3 讨论

临床上认为导致干眼病主要有以下原因：(1)长期戴隐形眼镜、自身免疫疾病引起的泪腺发炎、眼外伤、自律神经失调、眼部感染、先天性无泪腺以及长期使用眼药水导致的泪液分泌不足造成的水液层泪腺泪液分泌不足[4]；(2)因眼睑疾病引发的睑板腺功能不良出现油脂层分泌降低[5]；(3)慢性结膜炎、缺乏维生素A、化学性灼伤等造成的粘蛋白层分泌降低；(4)因疾病引起的眨眼次数少、眼睑闭合不良、长时间停留户外等导致泪液过度蒸发出现泪膜分布不均匀[6]。本实验以不给予维生素A进行干眼病家兔模型的建立，维生素A缺乏可直接引起泪腺腺体萎缩、结膜与角膜上皮干燥而造成干眼病症状[7]。本研究观察组雄兔每高倍镜视野角膜组织上皮细胞凋亡数量显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，证明角膜细胞凋亡可能作为重要原因影响干眼症的发生及发展。

Fas是神经生长因子以及肿瘤坏死因子受体系统家族的一员，有报道[8]证实无论是Fas表达于细胞表面的，还是纯化的FasL，只要能够结合细胞表面的Fas分子，使后者出现交联情况，能够将信号传递到细胞内，细胞便能发生凋亡[9]。本研究结果表明，干眼症兔角膜上皮细胞Fas蛋白的阳性表达细胞数较对照组明显要高，相关性分析结果显示与角膜组织上皮细胞凋亡呈正相关，表明干眼病患者角膜组织上皮细胞的凋亡过程可能有Fas参与介导。FasL、Bax的作用与Fas具有相似之处，其表达量增加也能促进细胞凋亡[10]，本研究结果显示Fas、FasL、Bax的表达与角膜组织上皮细胞凋亡呈显著正相关(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，证实角膜组织上皮细胞凋亡与Fas、FasL、Bax的高表达有明显的相关性。bcl-2主要在B淋巴瘤中分离得到，对细胞凋亡具有明显的抑制作用，因此我们认为正常细胞中bcl-2基因均处于较高表达的状态，而在凋亡细胞中其表达量可能降低，减弱了细胞凋亡的抑制作用，细胞凋亡加速[11,12]。本研究结果显示观察组每1000个角膜组织上皮细胞bcl-2阳性表达细胞数量显著低于对照组，相关性分析结果显示bcl-2的表达与角膜组织上皮细胞凋亡呈显著负相关，这也能有力证明bcl-2基因表达降低细胞凋亡加快的理论[13]。

虽然目前尚未完全对干眼病的发病机理进行确切的判定，但认为其与角膜上皮细胞的细胞凋亡有明显的关系。细胞凋亡参与干眼症发病机制可能有以下两个原因：(1)细胞凋亡导致泪腺和结膜杯状细胞受到影响，引起角膜上皮结膜化或鳞状化[14]；(2)细胞凋亡对炎症细胞及淋巴细胞的影响，炎症细胞分泌细胞因子对泪液分泌反射的正常神经联系产生影响，进而使泪腺的神经支配降低，使泪腺腺泡的萎缩加重[15]。

综上所述，角膜组织上皮细胞凋亡可能导致角膜组织上皮细胞出现干燥、变薄，引起功能减退，导致干眼病症状，这可能与Fas、FasL、Bax表达量增多，bcl-2的表达量降低加快角膜组织上皮细胞凋亡有关。

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RelationshipbetweenFas,FasL,Baxandbcl-2expressionindryeyecornealepithelialcellsinducedbyvitaminAdeficiencyandapoptosis

CONGYue,WANGWan-mei.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of Fas,FasL,Bax and Bcl-2 in dry eye corneal epithelial cells induced by vitamin A deficiency and apoptosis,and to provide the theoretical basis for the study of the pathogenesis of dry eye.MethodsThe experimental subjects were 5 male rabbits model with dry eye induced by vitamin A deficiency,and 5 normal feeding male rabbits,rabbits were respectively set as the observation group and the control group.The corneal epithelial cells apoptosis was surveyed by in situ end-labeling (ISEL) and immunohistochemistry method,followed by FasL,Fas,Bax,bcl-2 and other related gene protein expression in corneal epithelial cells to primarily explore the relationship between Fas,FasL,Bax and bcl-2 expression in dry eye corneal epithelial cells induced by vitamin A deficiency and apoptosis.ResultsThe corneal epithelial cells count of the observation group per high-power field of view was (4.89±1.34),while the control group was (0.65±0.32),the difference had statistical significance (P<0.05);The observation group’s Fas,FasL,Bax positive cells expression number per 1000 corneal epithelial cell were (187.35±23.23),(212.45±24.55),(168.67±21.43),which was sharply higher than those of the control group (65.23±18.23),(68.46±14.51),(48.43 ±16.46).The observation group’s Bcl-2 positive cells expression amount per 1000 corneal epithelial cells was (54.44±16.34),which was evidently lower than that of the control group (217.43±24.13) ,the difference showed statistical meaning (P<0.05);A positive correlation was found between Fas,FasL,Bax expression and apoptosis of corneal epithelial cells(r=0.675,r=0.785,r=0.678,P=0.000),bcl-2 expression was negatively related to the apoptosis of corneal epithelial cells(r=-0.754,P=0.000).ConclusionThe apoptosis of corneal tissue epithelial cells may lead to dry,thinning,hypofunction,dry eye symptoms,which may be related to the increase of Fas,FasL,Bax expression and corneal tissue epithelial cells apoptosis acceleration caused by bcl-2 expression decrease.

dry eye induced by vitamin A deficiency;corneal epithelial cells;Fas;FasL;Bax;Bcl-2;expression;apoptosis

R772.2

A

2016-12-30)

1007-4287(2017)10-1820-04