中药对湿热型溃疡性结肠炎小鼠NFκB p65及免疫功能的影响

刘思邈，唐艳萍，武文静，弓艳霞

实验研究

中药对湿热型溃疡性结肠炎小鼠NFκB p65及免疫功能的影响

刘思邈，唐艳萍，武文静，弓艳霞

目的：探讨清热利湿方对湿热型溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)小鼠不同时段结肠黏膜核转录因子κB(NFκ B)p65蛋白表达及相关免疫功能的影响。方法：选用80只SPF级雄性Balb/c小鼠,随机分为对照组、造模组、西药组、中药组，每组20只，除对照组外，其余3组采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠法配合饮食加环境复合法建立小鼠湿热型UC模型，术后西药组予以美沙拉嗪灌肠，中药组予以清热利湿方灌肠；第3 d、7 d每组各取10只小鼠观察血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IgA、黏膜sIgA水平，结肠黏膜NFκB p65蛋白表达情况。结果：造模组TNF-α、IgA、黏膜sIgA水平升高，NFκB p65蛋白表达增加，与对照组有显著差异（P＜0.01）；与造模组相比，中药组、西药组TNF-α、IgA、黏膜sIgA、NFκB p65蛋白表达下降（P＜0.01）；中药组与西药组相比，给药3 d，上述各指标无明显差异（P＞0.05）。给药7 d，中药组TNF-α为（240.16±16.24）pg/ mL、IgA为（161.46±28.75）ng/mL、黏膜sIgA为（18.25±2.20）μg/mL、NFκB p65蛋白表达阳性率为33.3%，较西药组TNF-α（290.58± 18.33）pg/mL、IgA（184.90±33.23）ng/m L、黏膜sIgA（20.86±1.84）μg/mL、NFκB p65蛋白表达阳性率（55.6%）明显降低（P＜0.05）。结论：湿热型UC动物模型造模成功，清热利湿方治疗湿热型UC疗效肯定，作用机制可能与抑制NFκB p65蛋白表达、降低TNF-α、IgA、黏膜sIgA水平等相关免疫指标有关，随疗程增加，中药疗效优于西药。

溃疡性结肠炎；清热利湿；核转录因子κB p65；黏膜sIgA

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因和发病机制尚未完全阐明、病变范围主要累及结直肠的慢性非特异性炎症性疾病[1]，目前被广泛认可的影响因素包括遗传、免疫、感染、环境等，属于中医“休息痢”“久痢”“久泻”等范畴，以腹痛、腹泻、粘液脓血便、里急后重为主要临床表现。常规治疗包括氨基水杨酸类（如柳氮磺胺吡啶）、激素、免疫抑制剂、生物制剂等，中医药在治疗疗效肯定[2]。本课题组通过前期临床实验研究发现，口服中药清热利湿方能够使湿热证UC患者血清肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IgA水平降低[3]，对于部分降乙结肠受累的患者通过给予中药保留灌肠也可有较好的效果[4]。本研究进一步观察不同时段中药灌肠对UC小鼠血清TNF-α、IgA、黏膜SIgA含量及结肠组织中核转录因子κB（nuclear factor kappaB，NFκB）p65蛋白表达的影响，以期从分子生物学水平探讨清热利湿方治疗UC的深层机制。

1 材料与方法

1.1 动物清洁级健康雄性Balb/c小鼠,6～8周龄,体质量18～22 g(中国医学科学院医学实验动物研究所提供)。动物合格证号SCXK（京）2016-0004。

1.2 主要仪器与试剂VMR小动物麻醉机（北京益仁恒业科技有限公司）、人工气候箱（广东省医疗器械厂）、小鼠灌胃针（北京健力园医疗器械有限公司）、721分光光度计16C-14型（上海精密科学仪器有限公司）、多管放射免疫γ计数仪DFM一96型（众成机电技术公司）。2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），购于Sigma公司；无水乙醇，北京化学试剂公司。TNF-α酶联免疫试剂盒、IgA酶联免疫试剂盒、黏膜SIgA放射免疫试剂盒、NFκB p65免疫组化试剂盒，购自北京市邦定生物工程公司，批号20150920。

1.3 药物制备清热利湿方组成以白头翁汤为主加减化裁而成，具体方药：白头翁30 g，黄柏10 g，黄连8 g，秦皮12 g，炒白芍30 g，炙甘草30 g，生地榆24 g，煨木香10 g，肉桂10 g，乌梅15 g，郁金18 g，鸡内金15 g。由天津市南开医院药厂制备成汤剂，常温储备，用前摇匀。美沙拉嗪缓释颗粒（5-ASA）法国爱的发制药集团生产，批号15682，规格0.5 g/片。中西药剂量按照根据《新药研究与方法》[5]不同动物剂量（mg/kg）折算系数（K）和简化倍数，小鼠K=1，简化倍数为9，成人中药组方约212 g/d，体质量以60 kg计算，剂量为3.5 g/kg,小鼠为32 g/kg。成人西药美沙拉嗪缓释颗粒(5-ASA)1.5 g/d，剂量为25 mg/kg,小鼠为0.22 g/kg。中药浓缩至2 mL汤剂，西药研碎以蒸馏水配成2 mL溶液，均置于4℃冰箱，使用前摇匀。

1.4 动物模型制备采用TNBS/乙醇溶液灌肠法配合饮食加环境复合法建立小鼠湿热UC模型[6]。（1）湿热型小鼠造模方法[7]：给予小鼠高脂高糖饲料（由北京华阜康生物科技股份有限公司提供），约15～20 g/(鼠·d)，自由饮用200 g/L的蜂蜜水。（2）湿热气候模拟：将造模小鼠置入人工气候箱，设置参数温度35℃，湿度85%；每日持续8 h。以上湿热造模共持续2周。（3）UC小鼠造模方法：湿热型小鼠造模成功后第2 d禁食36 h，自由饮水，采用改良TNBS联合乙醇复合造模法制备UC小鼠模型。

1.5 动物分组及给药正常对照组和单纯造模组均于造模后第2 d开始以生理盐水灌肠，每次1 mL，2次/d。造模后中药组和造模后西药组分别于造模后第2 d开始给予美沙拉嗪和清热利湿汤灌肠，2次/d（早8点，晚8点），每次1 mL。

1.6 观测指标及方法取血及测定:分组给药后第3 d和第7 d，禁食不禁水24 h，摘眼球取血0.5～1 mL置于干燥无菌试管中，室温静置自然凝固收缩，于37℃水浴中孵育20 min。以3000 r/min(相当于1368 g)离心10 min，分离血清，保存-20℃冰箱，用免疫比浊法检测血清IgA、酶联免疫法测定血清TNF-α水平，采血后处死动物，打开腹腔，游离大肠，用2 mL生理盐水反复灌洗3次后，洗出物吸出，用放射免疫分析法测定SIgA含量（放免γ计数仪测定），测定时按照试剂盒说明操作。

结肠大体标本及组织学观察：分别于用药3 d、7 d后，处死动物，打开腹腔，游离大肠，留取结肠灌洗液后沿肠系膜对侧剪开，固定，肉眼观察小鼠黏膜大体标本。取其远端结肠（距肛门0.5 cm）取大小约l cm×0.5 cm结肠组织，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，连续病理切片（HE染色）并显微镜观察黏膜病理组织学。测定黏膜NFκB p65蛋白表达，标本行脱蜡、水化、阻断内源性过氧化物酶、置EDTA抗原修复液中，95℃10 min，自然冷却至室温，PBS冲洗3次，每次2 min。⑴滴加非免疫性动物血清，37℃15 min，封闭非特异性抗原。⑵滴加NFκB p65单克隆抗体(1∶250)，4℃过夜，37℃复温60 min，PBS冲洗3次，每次2 min。⑶滴加生物素标记的二抗，37℃12 min，PBS冲洗3次，每次2 min。⑷滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育12 min，PBS冲洗3次，每次2 min。⑸应用DAB溶液显色。⑹蒸馏水冲洗，苏木素复染，脱水，中性树脂封片。⑺用PBS代替一抗作阴性对照。

免疫组化判定标准：随机选择5个高倍视野（× 200）下视野观察，以细胞膜上出现黄棕色或棕褐色颗粒为阳性表达细胞，根据阳性表达细胞所占百分比及其染色强度分别计分，两项之和0分为（-），1～3分为（+），4～5分为（++），6分为（+++），其中染色强度（阴性、弱、中、强）及阳性细胞表达率（≤5%，5%～30%、30%～70%、＞70%）分别计分为0、1、2、3分。

1.7 统计学方法以SPSS11.5统计软件进行数据处理,计量资料用均数±标准差(x±s)表示，计数资料用率(%)表示。自身前后比较运用t检验，组间差异用q检验，样本率的比较采用χ2检验和四格表精确概率法判断。P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异显著。

2 结果

2.1 一般及死亡情况对照组：小鼠毛光润亮泽，食欲好，粪便呈颗粒状，体质量增长正常。造模组小鼠造模后3 d出现大便稀塘，有脓血便，皮色逐渐干枯无光泽，活动减少，有拖尾现象，进食减少，较造模前体质量下降，7 d后粪便仍不成形，精神欠佳，皮毛无光泽。西药组及中药组用药3 d，小鼠毛色不光洁，活动少，食量少，大便开始好转，脓血便逐渐消失，大便基本成形，用药7 d精神状态、饮食及体质量均有较好恢复但皮毛欠光泽，一般情况略逊于正常对照组。造模大鼠3 d内死亡8只（造模组2只，西药组1只，中药组1只），7 d内死亡1只（造模组1只），3组间死亡率无统计学差异（P＞0.05）。死亡原因主要有肠坏死、腹腔感染等。

2.2 治疗3 d、7 d血清TNF-α含量造模后小鼠血清中TNF-α水平明显升高，与对照组相比差异有显著性（P＜0.01），造模后3 d与7 d相比差异有统计学意义（P＜0.05）。中药组和西药组治疗3 d，血清中TNF-α水平均降低，与造模组比较差异均有显著性（P＜0.01）。中药组和西药组治疗7 d，小鼠血清中TNF-α水平均进一步降低，与治疗3 d相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗7 d中药组与西药组组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠血清TNF-α结果比较（±s，pg/m L）

表1 各组小鼠血清TNF-α结果比较（±s，pg/m L）

注：与对照组比，aP＜0.01,与造模组比，bP＜0.01；同组内不同时间点比较，cP＜0.05

组别对照组造模组西药组中药组n n 10899治疗3 d 236.82±21.95448.54±31.93a 345.82±15.81a、b 342.14±16.87a、b 1091010治疗7 d 237.26±16.70410.45±16.45a、c 290.58±18.33b、c 240.16±16.24b、c

2.3 治疗3 d、7 d血清IgA含量造模后小鼠血清中IgA水平明显升高，与对照组相比差异有显著性（P＜0.01），造模后3 d与7 d相比差异有统计学意义（P＜0.05）。中药组和西药组治疗3 d，血清中IgA水平较前降低，与造模组比较差异均有显著性（P＜0.01）。中药组和西药组治疗7 d，小鼠血清中IgA水平均进一步降低，与治疗3 d相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗7 d中药组与西药组组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清IgA结果比较（±s，ng/m L）

表2 各组小鼠血清IgA结果比较（±s，ng/m L）

注：与对照组比，aP＜0.01,与造模组比，bP＜0.01；同组内不同时间点比较，cP＜0.05

组别n n治疗3 d 治疗7 d对照组造模组西药组中药组10899115.01±18.64261.76±24.87a 240.39±26.53a、b 232.54±26.15a、b 1091010135.78±32.35230.81±24.44a、c 184.90±33.23b、c 161.46±28.75b、c

2.4 治疗3 d、7 d黏膜SIgA含量造模后小鼠黏膜SIgA水平明显升高，与对照组相比差异有显著性（P＜0.01），造模后3 d与7 d相比差异有统计学意义（P＜0.05）。中药组和西药组治疗3 d，黏膜SIgA水平较前降低，与造模组比较差异均有显著性（P＜0.01）。中药组和西药组治疗7 d，小鼠黏膜SIgA水平均进一步降低，与治疗3 d相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗7 d中药组与西药组组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.5 治疗3 d、7 d黏膜NFκB p65蛋白表达造模后小鼠黏膜NFκB p65蛋白表达明显升高，与对照组相比差异有显著性（P＜0.01），造模后3 d与7 d相比差异有统计学意义（P＜0.05）。中药组和西药组治疗3 d，黏膜NFκB p65蛋白表达均降低，与造模组比较差异均有显著性（P＜0.01）。中药组和西药组治疗7 d，小鼠黏膜NFκB p65蛋白表达均进一步降低，与治疗3 d相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗7 d中药组与西药组组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4，图1～4。

表3 各组小鼠黏膜SIgA结果比较（±s，μg/m L）

表3 各组小鼠黏膜SIgA结果比较（±s，μg/m L）

注：与对照组比，aP＜0.01,与造模组比，bP＜0.01；同组内不同时间点比较，cP＜0.05

组别对照组造模组西药组中药组n n 10899治疗3 d 18.36±2.7628.70±2.68a 26.72±1.97a、b 25.55±2.54a、b 1091010治疗7 d 15.71±1.7225.08±2.92a、c 20.86±1.84b、c 18.25±2.20b、c

表4 各组小鼠黏膜NFκB p65蛋白表达结果比较

图1 正常对照组

图2 单纯造模组

图3 造模后用西药组

3 讨论

目前认为，UC是一种自身免疫性疾病，免疫应答在其发病机制中起一定作用。TNF-α在UC发病中被公认为是一种促炎因子，可促使肠上皮内淋巴细胞增殖、移行和分化，释放大量非特异性或特异性炎性分子，在肠黏膜局部起到免疫破坏作用，造成黏膜局限性溃疡、炎细胞的出现和延续。活动期UC患者血清TNF-α水平明显增高，提示TNF-α参与了UC的病理过程[8]。NFκB是一种能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生结合并促进其相关基因转录的蛋白质因子，参与调节多种炎症中有关基因的转录调控。研究表明，活化的NFκB可增强TNF-α表达增加[9]，促炎因子释放，加重肠黏膜损伤，最终诱发或加重UC[10]。近年来体液免疫特别是免疫球蛋白与该病的相关性研究也时有报道[11]，认为当肠上皮细胞屏障破坏后，肠组织就会暴露在肠道内容物中，肠道内容物就会刺激肠免疫系统，使肠免疫系统过度反应和错误识别，产生细胞和体液免疫反应，最终诱发UC[12]。IgA分为血清型和分泌型两种，前者存在于血液中，可介导调理吞噬抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[13]。分泌型IgA是人类黏膜免疫的主要抗体[14-15]，由黏膜相关淋巴组织产生，大部分是由胃肠淋巴组织合成，少部分由呼吸道和泌尿生殖道黏膜下淋巴样组织合成，主要存在于胃肠液、支气管和泌尿生殖道分泌液中，是黏膜局部免疫的最重要因素[16]。

大肠湿热证是临床UC常见类型[2]，主要症状为脓血便，病机为湿热蕴肠，脂膜血络受伤，治以清热利湿。代表方剂白头翁汤始见于《伤寒论·辨厥阴病脉证并治》：“热利下重者，白头翁汤主之。下利欲饮水者，以有热故也，白头翁汤主之”。本实验以白头翁汤加减化裁而成：白头翁、黄柏、黄连、秦皮、炒白芍、炙甘草、生地榆、煨木香、肉桂、乌梅、郁金、鸡内金。方中白头翁苦寒能入阳明血分，清热解毒，凉血止痢为君药；秦皮苦寒性涩，能凉肝益肾而固下焦；黄连凉心清肝，黄柏泻火补水，并能燥湿止痢而厚肠，取寒能胜热，苦能坚肾，涩能断下，故黄连、黄柏、秦皮可清热燥湿、泻火解毒为臣药；炒白芍养血和营、缓急止痛；郁金体清气窜，其气先上行而微下达，长于行气解郁、祛瘀止痛；煨木香、鸡内金行气消食导滞，“调气则后重自除”；生地榆止血收敛，配乌梅加强收敛止泻，共为佐药；肉桂其辛热温通之性，配在苦寒药中是为“反佐”能防止苦寒伤阳，冰伏湿热之邪；甘草补脾益气，清热解毒，和中调药，与芍药相配，又能缓急止痛，亦为佐使。诸药合用，湿去热清，气血调和，故下痢可愈。

课题组前期临床实验研究已证实[3]，清热利湿方有调节免疫、抑制炎症反应的作用，尤其对于复发、激素及免疫抑制剂不耐受、停药后反跳、激素依赖的患者，效果更为突出。本研究结合现代科研成果，在中医理论的指导下和临床经验的基础上，探讨以加味白头翁汤为代表方的清热利湿法对UC相关免疫功能影响。本次实验证实，清热利湿方可改善UC模型小鼠的一般状态，抑制UC的炎性细胞浸润，促进结肠黏膜损伤修复。其作用机制是多层次、多靶点的，可能是通过调节体液免疫和细胞免疫功能，下调TNF-α、IgA、SIgA水平，抑制NFκB p65蛋白表达，从而起到治疗UC的作用，且随疗程增加，中药疗效优于西药，为临床中医治疗UC提供很好的理论依据。

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Effect of Herbal Decoction on NFκB p65 and Immune Function in the Ulcerative Colitis Mice with Dampness Heat Syndrome

LIU Si-miao,TANG Yan-ping,WU Wen-jing,et al.Department of Gastroentolo⁃gy,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

ObjectiveTo investigate the effect of clearing heat and removing dampness herbal decoction on the protein expression of NFκB p65 and immune function in the colon tissue of mice with ulcerative colitis with dampness heat syndrome.MethodsEighty male Balb/c mice of SPF grade with 6-8 weeks old were ran⁃domly divided into control group,model group,Western medicine group and Chinese medicine group,with 20 mice in each group.Except for the control group,the remaining groups were given 2,4,6-trinitrobenzene sulfon⁃ic acid(TNBS)and ethanol enema combined with damp-heat type diet and environmental composite method to establish mice UC model.Western medicine group were administered with Mesalazine at the daily dose of 0.22 g/ kg by enema 1 mL BID;Chinese medicine group were administered with herbal decoction at the daily dose of 32 g/kg by enema 1 mL BID.Serum TNF-α,IgA,mucosal sIgA levels,NFκB p65 protein expression were de⁃tected in 10 mice of each group on day 3 and day 7.ResultsTNF-α,IgA,mucosal sIgA levels and NFκB p65 protein expression in model group were increased significantly than that in the control group(P＜0.01). Compared with the model group,the expression of TNF-α,IgA,mucosal sIgA,and NFκB p65 protein were de⁃creased in Western medicine group and Chinese medicine group.There was no difference for above parameters between Western medicine group and Chinese medicine group after 3 days treatment.In Chinese medicine group after 7 days treatmen,TNF-α（240.16±16.24）pg/ mL,IgA（161.46±28.75）ng/mL,mucosal sIgA（18.25±2.20）μg/mL and NFκB p65 protein expres⁃sion(33.3%)were significantly lower than those in Western medicine group with TNF-α（290.58±18.33）pg/mL, IgA（184.90±33.23）ng/mL,mucosal sIgA（20.86±1.84）μg/mL and NFκB p65 protein expression(55.6%).There was significant difference between two groups(P＜0.05).ConclusionThe UC mice model with dampness heat syndrome were successfully modeled.The effect of clearing heat and removing dampness herbal decoction in the treatment of damp-heat type UC was obvious.The mechanisms could be the inhibition of NFκB p65 pro⁃tein and decrease in the related immune indexes of TNF-α,IgA and mucosal sIgA levels.With the course of treatment increased,the curative effect of traditional Chinese medicine is better than that of Western medicine.

Ulcerative colitis;clearing heat and removing damp;nuclear factor kappaB p65;secretory im⁃munoglobulin A

Q95-33；R656.7

A

1007-6948(2017)05-0518-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.05.015

天津市中医药管理局课题资助项目（13044）天津市南开医院消化内科（天津300100）

唐艳萍，E-mail:cb1699@sina.com

（收稿：2017-07-26 修回：2017-09-30）

（责任编辑 刘洪斌）