益髓生血颗粒对辐射损伤小鼠骨髓细胞C/EBPα、GM—CSF、GM—CSFRα、MAFBmRNA表达的影响

岳竹君+王文娟+贾富霞

[摘要] 目的 觀察益髓生血颗粒对辐射损伤小鼠骨髓细胞CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、粒-单系祖细胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒-单系祖细胞集落刺激因子受体α（GM-CSFRα）、转录因子MAFB mRNA表达的影响，探讨该药调控骨髓造血的作用机制。 方法 采用随机数字表法将78只雄性昆明小鼠随机分为正常组、模型组、粒系祖细胞集落刺激因子（G-CSF）组及益髓生血颗粒高、中、低剂量组。益髓生血颗粒高、中、低剂量组先预防给药2 d，分别按12、6、3 g/（kg·d）灌胃。采用60Co-γ射线全身一次性照射造模。造模第2天，G-CSF组按30 μg/（kg·d）皮下注射G-CSF注射液，益髓生血颗粒高、中、低剂量组给药方法同预防给药，其余组均给予等量蒸馏水，连续14 d。进行小鼠骨髓细胞计数；采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测骨髓细胞C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表达。 结果 益髓生血颗粒能明显提高辐射损伤小鼠骨髓细胞计数（均P < 0.05），上调骨髓细胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表达（均P < 0.05），以低剂量组效果最佳。 结论 益髓生血颗粒可促进骨髓造血，其机制与上调骨髓细胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表达有关。

[关键词] 益髓生血颗粒；辐射损伤；CCAAT增强子结合蛋白α；粒-单系祖细胞集落刺激因子；粒-单系祖细胞集落刺激因子受体α；MAFB；基因表达

[中图分类号] R818.02 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（a）-0017-06

[Abstract] Objective To study the influence of Yisui Shengxue Granules on CCAAT/enhancer binding protein α （C/EBPα）， granulocyte-macrophage colon stimulating factor （GM-CSF）， granulocyte-macrophage colon stimulating factor receptor alpha （GM-CSFRα） and transcription factor MAFB mRNA expression in bone marrow cells of mice irradiated by 60Co-γ rays， and to explore its mechanism of promoting bone marrow hematopoiesis. Methods Seventy-eight male Kunming mice were randomly divided into normal control group， model group， granulocyte-colony stimulating factor （G-CSF） group， low-dose， middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group. Two days before modeling， mice in low-dose， middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group received 12， 6， 3 g/（kg·d） Yisui Shengxue Granules ig respectively. On modeling day except normal control group， mice were established by 60Co-γ ray in other five groups. The 2nd day after modeling， mice in G-CSF group received 30 μg/（kg·d） G-CSF by injection， mice in normal control group and model group received the same volume distilled water， mice in low-dose， middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group received the same way as before modeling， the course lasted 14 days. Bone marrow cells were counted. The mRNA expression of C/EBPα， GM-CSF， GM-CSFRα and MAFB in BM cells was analyzed by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction. Results The data showed that， Yisui Shengxue Granules could increase the count of bone marrow cells of mice irradiated by 60Co-γ rays （all P < 0.05）， and up-regulate the mRNA expression of GM-CSF， GM-CSFRα and MAFB in BM cells （all P < 0.05）. The effect of low-dose Yisui Shengxue Granules group was the best. Conclusion These results suggest that Yisui Shengxue Granules can promote bone marrow hematopoiesis， the mechanism may have some relation to up-regulating the mRNA expression of GM-CSF， GM-CSFRα and MAFB in BM cells.endprint

[Key words] Yisui Shengxue Granules； Radiation damage； CCAAT/enhancer binding protein α； Granulocyte-macrophage colon stimulating factor； Granulocyte-macrophage colon stimulating factor receptor alpha； MAFB； mRNA expression

益髓生血颗粒是基于中医“肾藏精生髓、髓生血”理论而组方的中药复方制剂，具有补肾健脾、益髓生血的功效。前期研究已证实该药对各类贫血均具有一定的改善作用，能明显促进红细胞、白细胞生成，有效提升血红蛋白水平[1-3]。相关机制研究表明，该药能明显促进骨髓造血，促进红系、粒系分化，调控细胞周期，并提升骨髓微环境中干细胞因子（SCF）、白细胞介素-3（IL-3）、粒-单系祖细胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒系祖细胞集落刺激因子（G-CSF）等造血生长因子含量[4-7]。为进一步明确益髓生血颗粒促进骨髓造血细胞向红系、粒系分化的具体机制，本研究采用小鼠骨髓急性辐射损伤模型，以益髓生血颗粒进行干预，通过观察各组间骨髓有核细胞计数，检测红系、粒系分化相关因子的基因表达来明确该药的具体作用。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性昆明种小鼠，体重（20±2）g（4周龄），SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物质量合格证号SCXK（京）2009-0007。实验动物送达后于清洁级动物房适应性饲养5 d，正常饲料喂养，自由摄食、饮水，饲养温度（22±1）℃，湿度40%～70%，噪声<60 dB，换气次数10～20次/min，光照模拟昼夜交替，光照时间每天12 h。本研究已获得单位伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂

益髓生血颗粒（益髓生血颗粒），由山茱萸、制何首乌、熟地、补骨脂、炙黄芪、党参、阿胶、当归、鸡血藤、鳖甲、砂仁组成，药物比例、制备工艺及质量标准均参照专利No.CN200610078866.X，中国中医科学院广安门医院大兴制药厂生产，12 g/袋，生药含量23.6 g（批号20110506）；重组人粒细胞刺激因子（G-CSF）注射液，厦门特宝生物工程股份有限公司生产，75 μg/瓶（批号201111B45）；分析纯氯仿、异丙醇、无水乙醇，均购自北京化学试剂公司；Trizol试剂，购自美国Invitrogen公司（批号14105）；Fermentas K1622 RT逆转录试剂盒，购自美国MBI公司（批号00044977）；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，购自美国应用生物公司（批号1201329）。

1.3 仪器

钴-60（60Co）远距离治疗机（中国核动力院设备制造厂生产）；7900HT型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；DU-600紫外分光光度计（BECKMAN公司）；高速冷冻离心机（BECKMAN公司）。

1.4 分组、造模与给药

采用随机数字表法将78只小鼠随机分为正常组、模型组、G-CSF組和益髓生血颗粒高、中、低剂量组，每组13只。造模前，益髓生血颗粒高、中、低剂量组先预防给药2 d，分别按12 g/（kg·d）（药液浓度1.2 g/mL，为临床成人日剂量的20倍）、6 g/（kg·d）（药液浓度0.6 g/mL，为临床成人日剂量的10倍）、3 g/（kg·d）（药液浓度0.3 g/mL，为临床成人日剂量的5倍）灌胃。造模当日采用60Co-γ射线全身一次性照射造成小鼠骨髓急性损伤，照射剂量为3.5 Gy，剂量率为1.31 Gy/min。造模第2天，G-CSF组按30 μg/（kg·d）（注射容积10 mL/kg）皮下注射G-CSF注射液，益髓生血颗粒高、中、低剂量组给药方法同预防给药，其余各组给予等量蒸馏水，连续14 d。

1.5 骨髓有核细胞计数

颈椎脱臼处死小鼠，剥取小鼠两侧股骨，用剪刀剪开股骨两头，暴露骨髓腔，用无菌注射器4号针头吸取2 mL PBS液（0.1 mol/L，pH 7.4），反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞。

将骨髓细胞吹打成单细胞悬液，取10 μL单细胞悬液，加990 μL生理盐水，吹打混匀。取10 μL混合液，从血细胞计数板边缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙，注意不要出现气泡。于10×10倍低倍镜下分别计数4个大方格中细胞数。每毫升细胞数=（4大方格内细胞数/4）×104×稀释倍数100。

1.6 实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测骨髓细胞CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、GM-CSF、粒-单系祖细胞集落刺激因子受体α（GM-CSFRα）、转录因子MAFB mRNA表达

1.6.1 RNA提取 将骨髓细胞悬液以2500 r/min（r = 14 cm）离心10 min去上清，分别加入1 mL Trizol裂解细胞，吹打混匀后按照Trizol试剂说明书提取骨髓细胞总RNA。以紫外分光光度计及1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的含量、纯度及完整性。

1.6.2 cDNA合成 按照Fermentas K1622 RT逆转录试剂盒说明书进行cDNA合成。取总RNA样品1～5 μg，用DEPC水稀释成11 μL，加入OligoDT 1 μL，于65℃加热变性5 min，快速在冰上冷却，加入5×Reaction Buffer 4 μL、RNA Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、M-MLV逆转录酶1 μL，反应总体积为20 μL，于42℃反应60 min，70℃加热10 min终止反应。

1.6.3 Q-PCR反应 按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书，在7900HT型荧光定量PCR仪上进行Q-PCR反应。反应体系：cDNA 1 μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，2×SYBR Green PCR Mix 10 μL，加DEPC水至总体积20 μL。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，引物序列见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性35 s，53℃退火35 s，72℃延伸50 s，共40个循环；72℃后延伸8 min。整个反应过程中收集荧光信号，反应结束后使用PCR仪自带软件分析PCR过程中每个反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，即循环阈值（Ct值）。做熔解曲线判断PCR反应的特异性，做扩增曲线判断PCR的扩增效果。endprint

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布者，以均数±标准差（x±s）表示。多组间差异的显著性分析，符合正态分布者采用单因素方差分析进行统计推断，非正态分布者采用秩和检验进行统计推断。组间比较，方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett's T检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓有核细胞计数

经单因素方差分析及LSD检验，结果显示：造模小鼠骨髓有核细胞数均恢复至正常组水平，但益髓生血颗粒高、中、低剂量组骨髓有核细胞计数明显高于模型组，差异有高度统计学意义（均P < 0.01）。說明益髓生血颗粒能有效提高辐射损伤小鼠骨髓有核细胞数，对骨髓造血具有一定的促进作用。各组小鼠骨髓有核细胞计数见表2。

2.2 骨髓细胞C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表达水平

GAPDH、C/EBPα、MAFB的熔解曲线均为单一峰，并且没有加宽和变形，说明为特异性片段扩增；GM-CSF、GM-CSFRα的熔解曲线主峰后面出现小峰，经琼脂糖电泳证实是引物二聚体所致，与退火温度偏低有关。各基因的扩增曲线均指数扩增期明显，表现出较为理想的扩增曲线，表明本研究数据足够应用于基因的相对定量分析。各基因的熔解曲线及扩增曲线见图1～5。

采用2-ΔΔCT法进行基因的相对定量分析。经单因素方差分析及LSD检验，结果显示：各组小鼠骨髓细胞C/EBPα mRNA表达水平差异无统计学意义（均P > 0.05）；益髓生血颗粒低剂量组小鼠骨髓细胞GM-CSF mRNA表达明显高于正常组及模型组（均P < 0.05）；益髓生血颗粒低剂量组小鼠骨髓细胞GM-CSFRα mRNA表达明显高于正常组（P < 0.05）；益髓生血颗粒高、中、低剂量组小鼠骨髓细胞MAFB mRNA表达明显高于正常组及模型组（均P < 0.05）。见表3。

3 讨论

骨髓是对辐射极为敏感的组织，机体短时间内受到超过一定剂量的辐射照射可引发骨髓造血功能严重受损，造血细胞有丝分裂停止，细胞更新中断，外周血中各类血细胞数量剧烈下降。其中辐射诱导的造血干、祖细胞凋亡主要引发急性骨髓抑制，而其诱导的造血干细胞衰老及分化则可引发长期骨髓抑制[8-9]。中医根据骨髓抑制患者面色苍白、神疲乏力、头昏眩晕、心悸失眠、食欲不振等临床表现，多将该病症归属于“血虚”“虚劳”等范畴[10-11]。中医理论认为，血液的生成离不开后天之本脾和先天之本肾，其中脾为气血化生之源，而肾藏精生髓，髓又可化血。因此要改善骨髓抑制，应当从脾肾入手，以补肾健脾、益髓生血为基本治法。

益髓生血颗粒就是基于上述治法组方而成的中药制剂，方中山茱萸、制何首乌、熟地、补骨脂、鳖甲补肾益精生血，炙黄芪、党参、砂仁、阿胶、当归、鸡血藤健脾开胃养血活血。临床研究证实该药能有效改善肿瘤放化疗引发的骨髓抑制[1]。实验研究证实，益髓生血颗粒可显著升高辐射损伤小鼠外周血白细胞数、红细胞、血小板数及血红蛋白水平[12-13]，可通过促进骨髓细胞由G0/G1期进入S期而明显促进细胞增殖[6]，还能显著增加骨髓造血微环境中造血生长因子GM-CSF、IL-3、SCF含量[7]，说明益髓生血颗粒可有效改善辐射损伤引发的急性骨髓抑制，具有促进骨髓造血的作用。

为进一步探讨益髓生血颗粒促进骨髓造血的机制，本研究采用小鼠骨髓急性辐射损伤模型，首先观察了益髓生血颗粒对辐射损伤小鼠骨髓有核细胞的影响。相关研究显示，经辐射照射后小鼠骨髓有核细胞数明显下降[14]。本研究结果显示，经过一段时间的恢复，辐射损伤小鼠骨髓有核细胞数已恢复至正常水平，但益髓生血颗粒组小鼠骨髓有核细胞数明显高于模型小鼠（P < 0.01），说明益髓生血颗粒能有效提高辐射损伤小鼠骨髓有核细胞数，对骨髓造血具有明显的促进作用。本研究选取了对骨髓造血细胞增殖分化具有重要作用的4个相关因子C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFR、MAFB，对其在骨髓细胞中的基因表达水平进行研究，其中C/EBPα在造血系统中只表达于髓系细胞，主要在转录水平调控粒系和单核系的分化[15-16]。GM-CSF是具有广谱效应的造血生长因子，对髓系造血祖细胞具有广泛的促增殖活性，它通过与其高亲和力受体GM-CSFR结合而发挥生物学效应，二者结合后尤其对粒-单系血细胞具有重要调控作用[17-19]。MAFB可影响髓系前体细胞的增殖和分化[20]。实验结果显示，益髓生血颗粒对C/EBPα mRNA表达水平无明显作用（P > 0.05），而对GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表达具有上调作用（均P < 0.05）。

综上所述，本研究提示益髓生血颗粒能显著促进辐射损伤小鼠骨髓造血，其作用机制与上调骨髓细胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB的mRNA表达和促进髓系增殖分化有密切关系。

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（收稿日期：2017-05-04 本文編辑：张瑜杰）endprint