芒柄花黄素对人膀胱癌细胞T739增殖、凋亡的影响及机制探讨

柳青+梁梅花+张幸

[摘要] 目的 观察芒柄花黄素对人膀胱癌细胞T739增殖与凋亡的影响及其机制探讨。 方法 分别采用0、15、30、60 μmol/L的芒柄花黄素作用T739细胞后，CCK8法检测T739细胞的增殖情况，流式细胞术检测凋亡率的变化，Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡情况，Western blot检测GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白含量变化。 结果 15、30、60 μmol/L的芒柄花黄素以浓度和时间依赖方式明显抑制T739细胞的增殖（P < 0.05），且作用T739细胞48 h后凋亡率随药物剂量增加显著上升（P < 0.05），呈浓度-效应关系。Hoechst33258染色显示T739细胞随药物浓度的升高，凋亡明显增多。Western blot法显示GSK-3β及Axin蛋白表达随药物浓度升高而增加（P < 0.05），β-catenin蛋白水平则随药物浓度升高而降低（P < 0.05），且均呈浓度-效应关系。 结论 芒柄花黄素对T739细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用，其机制可能与芒柄花黄素上调GSK-3β、Axin蛋白表达和降低β-catenin蛋白水平有关。

[关键词] 芒柄花黄素；T739；凋亡；GSK-3β；Axin；β-catenin

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（a）-0004-04

[Abstract] Objective To study the effect of formononetin on the proliferation and apoptosis of human bladder cancer cells T739 cells， and discuss the mechanism. Methods Different contents of 0， 15， 30， 60 μmol/L formononetin were added to T739 cells. CCK8 assay was applied to determine the effect of formononetin on proliferation of T739 cells. Apoptosis was analyzed by flow cytometry and Hoechst33258 staining. The expressions of GSK-3β， Axin and β-catenin proteins in T739 cells were determined by Western Blot. Results Different contents of 15， 30， 60 μmol/L formononetin treatments suppressed the proliferation of T739 cells in a time- or dose-dependent manner （P < 0.05）， and the apoptotic rates of formononetin-treated T739 cells for 48 hours were increased in a dose-dependent manner （P < 0.05）. In addition， Hoechst 33258 staining revealed that the apoptotic cells of formononetin-treated T739 were increased in a dose-dependent manner. Further， Western blot results showed that formononetin significantly up-regulated the protein levels of GSK-3β and Axin in a dose-dependent manner （P < 0.05）， while the protein level of β-catenin was inhibited （P < 0.05）. Conclusion Formononetin exerts inhibitory growth effect and induced apoptosis on human bladder cancer of T739 cells. The underlyng mechanism involved may be associated with activating GSK-3β and Axin expressions and inhibiting β-catenin activity in T739 cells.

[Key words] Formononetin； T739； Apoptosis； GSK-3β； Axin； β-catenin

膀胱癌是泌尿外科最常見的恶性肿瘤[1]。由于近年来膀胱癌发病率呈上升趋势，所以受到越来越多的关注[2]。目前临床上首选手术治疗，但是术后复发率极高[3]。因此，寻找一种高效低毒的药物对防治膀胱癌有着重要意义。芒柄花黄素来源于植物红三叶草，能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡[4-6]。课题组近年来研究发现芒柄花黄素可以通过p38/Akt及IGF-1/IGF-1R信号通路诱导前列腺癌细胞凋亡，还能通过IGF1/PI3K/Akt通路诱导乳腺癌细胞凋亡[7-9]。而芒柄花黄素对人膀胱癌细胞T739增殖、凋亡的影响及机制却未见报道。因此，本文通过研究不同浓度芒柄花黄素对T739细胞增殖、凋亡产生的影响和T739细胞GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白表达水平的变化，进一步探讨其作用机制。endprint

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

芒柄花黄素（Formononetin，纯度>98%）、二甲基亚砜（DMSO，纯度98%）、荧光染料Hoechst33258购自美国Sigma公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，人膀胱癌细胞株T739由中科院上海细胞生物研究所提供，实验所用GSK-3β、Axin、β-catenin一抗均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠IgG二抗为北京中杉金桥生物技术公司生产，CCK8试剂盒、V-FITC凋亡检测试剂盒购自上海碧云天研究所，总蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，全自动酶标板分析仪由美国Bio-Rad公司生产，FACSAriaⅢ流式细胞仪由美国BectonDickson公司生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人膀胱癌细胞T739在37℃、5% CO2环境下置于含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基培养。

1.2.2 药物配制 芒柄花黄素与二甲基亚砜溶液配成浓度为100 mmol/L药液，置于4℃冰箱避光保存，待使用时以完全培养基按比例稀释成0（对照组）、15、30、60 μmol/L浓度药液。

1.2.3 CCK8法检测T739细胞的增殖活性 取对数生长期T739细胞，以细胞浓度6×103个/孔，每孔100 μL细胞悬液接种于96孔培养板中，在细胞培养箱内培养24 h后取出，弃培养液，分别加入“1.2.2”项下浓度药液，每组设5个复孔。继续孵育24、48、72 h后，避光每孔加入10 μL CCK8溶液，继续培养2 h后取出，酶标仪于450 nm波长测定吸光度OD值，实验重复3次，结果取算数均数。细胞增殖抑制率=（1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值）×100%。

1.2.4 流式細胞术检测T739细胞的凋亡率变化 取对数生长期T739细胞接种于6孔板。12 h细胞贴壁后去上清液，分别加入“1.2.2”项下浓度药液继续培养48 h后用胰酶消化成单细胞悬液，PBS清洗3遍，2000 r/min离心5 min，之后弃掉上清液，每管加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL Propidium Iodide，混匀室温避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，结果取算数均数。

1.2.5 Hoechst染色观察T739细胞凋亡情况 取对数生长期T739细胞接种于6孔板，12 h细胞贴壁后去上清液，分别加入“1.2.2”项下浓度药液，继续培养48 h后，弃培养基，加入0.5 mL固定液，10 min后弃固定液，PBS清洗2遍，加入0.5 mL Hoechst33258染色液，避光染色5 min。在荧光显微镜下观察细胞的形态（激发波长为350 nm，发射波长为460 nm），实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测T739细胞GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白表达 取“1.2.2”项下浓度药液孵育48 h后的细胞，提取总蛋白，用考马斯亮兰法（Bradford micro）测定样品蛋白浓度。每孔20 μL上样，浓缩胶电泳电压为80 V，分离胶电压为130 V，电泳4 h后，PVDF膜半干转，时间为1.5 h。用含5%脱脂奶粉的PBS液封闭1 h，之后分别加入GSK-3β、Axin、β-catenin抗体（抗体稀释度1∶500）4℃过夜，次日TBS洗膜3次，每次10 min，洗膜后用HRP标记的二抗（抗体稀释度1∶5000）室温反应1 h，于暗室中用超敏化学发光法曝光胶带。采用凝胶分析系统记录条带光密度并且图像分析系统分析，以蛋白条带的积分光密度值反映检测蛋白相对强度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芒柄花黄素对T739细胞增殖的影响

与对照组相比，15、30、60 μmol/L的芒柄花黄素在分别作用24、48、72 h后，T739细胞的增殖受到不同程度抑制（P < 0.05），增殖抑制率随着药物浓度升高和时间延长而增加。见表1。

2.2 芒柄花黄素对T739细胞凋亡的影响

相比对照组，15、30、60 μmol/L的芒柄花黄素作用48 h后T739细胞凋亡率明显升高，呈浓度-效应关系（P < 0.05），见表2。Hoechst 33258染色观察发现，对照组和细胞核完整，形态饱满，而药物组可见细胞核呈致密浓染，严重时甚至裂解为碎块，产生凋亡小体。随着药物浓度的升高，细胞的凋亡越明显，呈剂量依赖性。见图1。

2.3 芒柄花黄素对T739细胞GSK-3β、Axin、β-catenin蛋白表达的影响

15、30、60 μmol/L的芒柄花黄素处理T739细胞48 h后，GSK-3β的表达水平分别上调至对照组的（1.530±0.034）、（2.110±0.042）、（2.500±0.047）倍（P < 0.05），Axin的表达水平分别上调至对照组的（1.390±0.022）、（1.571±0.027）、（1.733±0.036）倍（P < 0.05），而β-catenin的表达水平分别下降到对照组的（0.890±0.024）、（0.692±0.021）、（0.491±0.023）倍（P < 0.05）。见图2。

3 讨论endprint

近年来，从植物中提取药物用于抗肿瘤治疗已成为目前研究的新方向[10]。从红三叶草中提取的芒柄花黄素是一种生物活性异黄酮，目前已有研究报道芒柄花黄素具有较强抗肿瘤作用，可通过多种途径抑制肿瘤细胞株的生长及诱导其发生凋亡[11-13]。但对人膀胱癌细胞T739的作用及其机制还未见国内外报道。

本实验CCK8法证实了芒柄花黄素对T739细胞具有抑制增殖作用，且此作用随药物浓度的升高和时间延长而增强。随后进行的流式细胞仪检测和Hoechst 33258染色结果显示，T739细胞出现不同程度的凋亡，凋亡率随药物浓度升高而增加，这与CCK8实验结果相符。因此推测芒柄花黄素对膀胱癌的抑制增殖作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。

Wnt信号通路的经典途径是Wnt/β-catenin途径，该途径参与多种肿瘤恶性生物学行为的调节，其各组成成分均可能与膀胱癌的浸润和转移密切相关，主要通过促进癌细胞的迁移黏附和肿瘤血管生成，以及诱导细胞增殖等方式参与膀胱癌的浸润及转移[14-15]。Wnt/β-catenin信号通路的机制是阻滞了β-catenin的降解，使β-catenin逐渐蓄积在细胞浆内，由此进入到细胞核与TCF-4结合，启动c-myc、cyclin D1、MMP-7、VEGF等基因转录，导致多种恶性肿瘤的产生和发展[16-19]。因此，β-catenin的过多蓄积与肿瘤的异常增殖及侵袭转移有重要关系。Axin为细胞内的主要架构蛋白（scaffold），它能同GSK-3β、大肠腺瘤息肉样蛋白（APC）构成复合体，促使β-catenin磷酸化并降解，进而使Wnt/β-catenin通路处于低活性状态[20]。因此，Axin与GSK-3β在Wnt/β-catenin信号通路中扮演“抑瘤因子”的角色，β-catenin扮演“促瘤因子”角色。本实验研究结果表明：芒柄花黄素能呈剂量依赖性地抑制T739细胞的增殖并能诱导其凋亡，此种作用可能与其能抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，表现为Wnt/β-catenin信号通路中的GSK-3β、Axin表达随芒柄花黄素浓度增加而升高，β-catenin表达随芒柄花黄素浓度增加而降低。

综上所述，芒柄花黄素对膀胱癌T739细胞的增殖有明显剂量、时间依赖性抑制作用，并且能诱导凋亡，其机制可能与激活GSK-3β、Axin表达，降低β-catenin表达，从而抑制Wnt/β-catenin信号转导有关。

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（收稿日期：2017-03-30 本文编辑：程 铭）endprint