超声靶向破坏微泡定位释放技术促基因转染最佳参数的研究进展

马洁+++穆玉明

[摘要] 运用超声靶向破坏微泡定位释放技术（UTMD）最重要的是参数的优化，应满足既可以获得高的转染效率的同时又对大部分细胞没有损害。目前许多研究都致力于将转染率高、组织损伤小的转染参数进行优化，但影响转染效果的因素有很多，如超声强度，占空比，辐照时间，微泡浓度，微泡性质，质粒浓度，不同细胞种类等，本文就目前UTMD技术促基因转染最佳参数进行综述，期望为UTMD更好的应用于基因治疗提供研究基础。

[关键词] 超声；微泡；转染；参数

[中图分类号] R445.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（b）-0033-04

Research progress of ultrasound-targeted microbubble destruction technology promoting gene transfection with optimal parameters

MA Jie MU Yuming

Department of Echocardiograrhy， First Affliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] The optimization of parameters is the most important in ultrasound-targeted microbubble destruction （UTMD）， this parameter should achieve both high transfection efficiency while at the same time most of the cells without damage. At present， many studies have focused on optimizing the transfection parameters for those with high transfection efficiency and small tissue damage. However， there are many factors that affect the transfection effect， such asultrasound intensity， duty cycle， irradiation time， microbubble concentration， microbubble properties， plasmid concentration， different cell types. This article reviewes the best parameters of gene transfection in UTMD， and expectes to provide a basis for UTMD to be better applied to gene therapy.

[Key words] Ultrasound； Microbubbles； Transfection； Parameter

超聲靶向破坏微泡定位释放技术（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一种新型的无创性基因转移技术，UTMD介导的基因治疗以其低免疫原性、非侵袭性、靶器官高度特异性以及可以增强大分子通过质膜穿透能力等特点，可明显提高基因转染率。然而获得较高的基因转染率，需要对有关转染参数进行系统研究并优化，由于不同的转染参数对不同组织细胞具有不同的生物学效应，而目前UTMD技术促进基因转染尚无统一优化的参数指标，因此，深入研究最佳转染参数以提高基因转染率成为目前的研究方向，本文就此问题进行综述，期望为UTMD技术更好的运用于基因治疗奠定基础。

1 UTMD的概念

UTMD是指在体内或体外以微泡作为基因载体，在合适的超声辐照条件下，微泡逐渐或突然活化或爆破，产生一系列生物学效应，如一过性的使细胞膜通透性增加，从而促进靶基因或药物进入感兴趣细胞或组织[1-3]，且不会干扰基因在细胞内表达，是一种理想的基因载体传递方法[4-5]。研究表明超声破坏微泡造影剂时，产生的机械作用和空化作用可以增加细胞膜的通透性、导致微血管破裂、内皮细胞间隙增宽，从而促进外源性的目的基因进入靶细胞[6-7]，增强目的基因的转染及表达效率[8]。UTMD作为一种非侵袭性的靶向基因传递方法[9-10]，具有运输和释放特殊物质到靶组织和靶器官的潜力[11]，可以改变局部微环境[12]，可以促进干细胞归巢[13]，已成为一种极具潜力的基因传递方法。

2 UTMD促进基因转染的机制

为了促进UTMD技术更好的发展，了解UTMD机制并分析其在超声、微泡、细胞和组织中复杂的交互作用，才能更好地理解UTMD技术在基因转染中的发展和作用[14-17]。UTMD技术的基本原理是在特定部位进行适当的超声辐照，携带目的基因的微泡在特定部位发生空化效应，使目的基因或药物到达靶组织或细胞。空化效应是超声作用于液体和气态夹杂物（空化核）之间的一种物理现象，有两种类型的空化：稳定空化和瞬时空化。在稳定空化中，由于所施加的声压，空化核经历周期性和规则的变化；在瞬时空化的情况下，虽然空化核也受所施加的声压进行周期性变化，但空化核的体积会迅速增大，继而猛烈地爆破[18]。微泡可以由脂质，白蛋白，糖类，生物相容性聚合物和其他材料组成[19-20]，由于其反射超声的物理特性，传统上被作为超声对比剂；微泡作为空化核可以在超声波作用下扩张和收缩，当声压达到更高水平时就会发生破裂，因此微泡作为基因载体可以在感兴趣的位点以高的局部浓度释放，通过外源性给予超声微泡来增加空化核的数目极大程度地增加了超声辐照引起空化效应的可能性[21-22]，UTMD通过空化效应可以增加细胞膜的通透性，增加基因转染的有效性，是一种新颖的药物和基因传递的方法。UTMD技术已广泛应用于各种体内和体外研究中[23-25]，为靶向基因治疗提供了一个极具前景的方式[26-27]。endprint

3 UTMD促骨髓干细胞及神经干细胞基因转染最佳参数的研究

UTMD的参数变化可以导致各种不同的声孔效应，许多研究都致力于通过发现最佳参数来减低对细胞的毒性和增加转染率，即基因转染的最佳条件是使细胞膜的通透性在不引起细胞不可逆损伤的前提下尽可能的增大。干细胞在组织修复和器官再生的基因治疗中具有很多优势，因此研究超声辐照频率、辐照强度、辐照时间、占空比、微泡浓度，通过固定其中某些参数，寻找其他参数的最佳配比，提高干细胞的基因转染率，为基因治疗提供实验基础。Li等[28]利用UTMD技术介导增强型绿色荧光蛋白（pEGFP-HGF）标记的肝细胞生长因子（HGF）转染鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs），固定超声辐照频率1 MHz，占空比10%，筛选出超声辐照强度=0.6 W/cm2，微泡浓度=106/mL，辐照时间=30 s时，转染率达最高水平且对BMSCs活力没有影响。陈玲玲等[29]利用UTMD介导5-氮杂胞甘转染人骨髓间质干细胞（MSCs），固定超声辐照频率1 MHz，占空比50%，筛选出辐照强度为0.55 W/cm2，辐照时间为30 s，微泡数/干细胞数比值为50的最佳转染参数，此条件下MSCs的活性无明显抑制且有一定的空化效应。研究发现，微泡浓度不同对神经干细胞存活率与基因转染率的影响较大，固定超声声强1.5 W/cm2，照射时间60 s，占空比为10%，微泡浓度为20%，细胞存活率及基因转染率较微泡浓度为10%、30%高，可作为神经干细胞基因转染的适宜条件[30]。

4 UTMD促肿瘤细胞基因转染的最佳参数的研究

基因治疗为目前一些无法治愈的疾病，如肿瘤、糖尿病、遗传性疾病，提供了一种新的治疗方法。有效的基因转染也需要较高的质粒浓度，通过优化超声参数，微泡浓度，质粒浓度等影响转染率的因素，UTMD技术可提高肿瘤组织血管通透性，从而促进病变区域血药浓度的上升及目的基因的表达，进而加强肿瘤治疗效果。陈智毅等[31]选用 Ishikawa、Hela和MCF-7三种细胞系为研究对象，超声强度为1.0 W/cm2，系统研究不同参数下的细胞活力及两种DNA质粒[红色荧光蛋白质粒（DsRed）和荧光素酶质粒（pCMV-LUC）]的基因转染情况，优化UTMD的转染条件（质粒浓度、占空比、辐照时间），研究表明随着质粒浓度的增加，基因转染率逐渐增高，當质粒浓度达到30 μg/孔时目的基因转染率达最高；20%占空比的转染率显著提高；辐照3 min时基因表达率最高，细胞存活率无明显下降，为最佳辐照时间。何颖等[32]在超声联合脂氟显微泡转染HepG2细胞的参数优化研究中发现，超声强度1.2 W/cm2、占空比为20%，辐照时间小于90 s时HepG2细胞转染率相对较高；刘同刚等[33]研究发现在超声声强为2 W/cm2、占空比为20%、照射时间为60 s时，HepG2细胞的转染率最高，这与何颖等的研究结果相同。马少增等[34]用72只肝癌大鼠模型将UTMD技术进一步优化，促进肿瘤靶区微血管通透性的提高，研究表明当微泡剂量为30 μL/kg联合辐照时间10 min、机械指数=1.3可最大限度地提高肿瘤组织的血管通透性。

5 UTMD促其他种类细胞基因转染的最佳参数的研究

UTMD技术运用于各种体内体外实验中，很多研究仅叙述了部分参数，缺乏对转染参数的系统性研究和优化，通过对超声参数，微泡浓度，质粒浓度，细胞状态的全面优化，在不同种类的细胞中均可获得的较高的转染率。Zhou等[35]利用UTMD技术介导hAng-1基因体外转染293T细胞，超声辐照频率在0.5～2 MHz范围内，通过测定细胞转染率和细胞活力来测定最佳转染参数，研究表明，超声辐射强度>1.5 W/cm2，辐照时间>30 s，微泡浓度>20%，hAng-1表达显著下降，伴随细胞死亡；质粒浓度<15 μg/mL时，基因转染水平较低；细胞处在悬浮状态下，基因转染率显著增加。李银鹏等[36]研究发现在相同转染参数下，悬浮状态细胞转染率为（7.33±0.98）%。存活率为（90.37±1.80）%；贴壁状态细胞转染率为（1.56±0.81）%，存活率为（81.10±1.26）%；在悬浮状态下，提高质粒和微泡浓度，转染率增至（15.63±1.81）%，且细胞生存率>80%，研究表明相同转染条件下悬浮状态细胞转染率及存活率明显优于贴壁状态，并且通过优化质粒、微泡浓度可进一步提高基因转染率和细胞存活率。目前大多数研究通过先固定某个转染参数，然后寻找与之相匹配的其他最适转染参数，以获得较高的基因转染率。丁尚伟等[37]在不固定单个参数的前提下，利用参数之间的相互组合，发现质粒浓度固定为15 μg/mL、超声辐照频率为1 MHz、辐照强度为2.0 W/cm2、辐照时间45 s、微泡浓度30%，293T细胞的转染效率最佳，细胞存活率最高。Li等[38]利用UTMD介导PHD2-shRNA转染大鼠心肌细胞（H9C2），研究发现固定超声频率=1 MHz，占空比=20%，当超声辐照强度为1.5 W/cm2，辐照时间为45 s，微泡浓度为300 μL/mL，质粒浓度为15 μg/mL，转染效果最佳并对H9C2细胞活力没有影响。Shi等[39]通过UTMD在Tregs中评估了金属蛋白酶组织抑制剂（Timp3）小干扰RNA（siRNA）质粒传递的适当参数，研究表明超声联合微泡显著提高了Tregs的转染率；超声和微泡均可影响Tregs增殖，Tregs转染率最佳条件为10%微泡，暴露时间为150/180 s，超声机械指数为1.4。

6 小结与展望

UTMD技术是一种介导基因转染的有效方法，不同参数下转染率差别较大，优化参数有利于促进基因转染。就如其他新颖的基因治疗方法一样，UTMD技术也面临着诸多挑战，超声空化现象可以提高基因的转染效率但也会导致细胞毒性效应，可以损伤血管内皮和其他组织细胞，导致毛细血管破裂出血[40]、细胞溶解[41]、激活血小板[42]，导致肾脏损伤[43]，目前大多数体外实验或动物模型实验中UTMD技术的研究尚处在实验阶段，不同微泡、质粒、细胞及超声转染参数的转染率差异较大，最佳转染参数有待进一步优化，以寻求最佳的转染条件的统一标准，增强目的基因转染率。相信随着细胞生物学、干细胞组织工程和生物工程等多学科的发展，UTMD技术促基因转染将会为临床带来更为广阔的前景，并可安全、有效地应用于临床治疗中。endprint

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（收稿日期：2017-06-12 本文編辑：苏 畅）endprint