AtPHO2的CRISPR/Cas9靶向敲除及其在拟南芥中功能分析

王钊辉， 石超男， 杨天啸， 薛亚东， 孙虎威， 唐贵良， 张战辉

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450002)

AtPHO2的CRISPR/Cas9靶向敲除及其在拟南芥中功能分析

王钊辉， 石超男， 杨天啸， 薛亚东， 孙虎威， 唐贵良， 张战辉

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450002)

利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对AtPHO2进行精确编辑，在拟南芥转基因后代中筛选到3个Atpho2阳性突变体。突变体中AtPHO2的表达量下降了10 倍。对获得突变体的表型及无机磷含量变化进行分析，结果表明，突变体叶片衰老速度明显快于野生型，突变体叶片无机磷含量是野生型的2～4倍。随着衰老进程的推移，地上部新叶中无机磷含量逐渐增加，突变体中由于磷代谢途径受阻而大量积累。本研究也表明，AtPHO2不仅可能通过磷代谢调控来响应非生物胁迫，而且与拟南芥的衰老进程存在紧密联系。

拟南芥；基因组编辑技术；规律成簇短回文重复序列；泛素结合酶24；磷代谢

磷是植物生长发育过程中所必需的营养元素之一，不仅是核酸、磷脂等生物大分子的主要组分，而且参与了能量转移、酶促反应、代谢调控等途径。尽管磷元素在植物生活史的各阶段中均具有不可替代作用，而且土壤中的总磷含量丰富[1-2]，但自然界中大部分磷元素处于被吸附、沉淀或有机磷状态，不能被植物直接利用[3-4]。经过长期的进化与自然选择，植物在低磷或缺磷条件下会产生一系列应激反应，以增加磷的吸收，保证植物的正常生长发育[5]。目前，相关研究已鉴定到一定数量参与低磷或缺磷应激反应的重要基因，如SIZ1[6]，PHR1[7]，PHO2[8]，PHT1[9]，NLA[10-11]等。其中PHO2编码1个含有UBC结构域的泛素结合酶E2(UBC24)，负责调控磷元素的吸收与转运[12-14]。但该基因调控拟南芥磷代谢和磷逆境响应的分子机制还不清楚。

近20 a来，随着基因组编辑技术迅速发展，如ZFNs(Zinc Finger Nucleases)[15-17],TALENs (Transcription Activator Like Effector Nucleases)[18]，以及CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated 9)[19-20]等技术相继被开发和利用。这些编辑技术都可以特异识别靶基因序列，通过核酸酶的剪切产生DNA 的双链断裂，并激活细胞自身的修复机制。生物细胞在修复过程中，损伤DNA 以非同源末端连接(Non Homologous Ending Joining，NHEJ)或同源重组(Homologous Recombination，HR)两种不同的机制进行修复，其中NHEJ 修复可以产生单碱基的插入缺失，或者在缺口处引入小片段的插入或缺失，最终由于发生移码、插入缺失等突变而影响基因表达[18,21]。CRISPR/Cas9 系统中，sgRNA 是具有特殊结构的小RNA，通常由RNA 聚合酶Ⅲ转录、U3/U6 系列启动子驱动[22-23]，与靶位点特异性结合并引导Cas9 蛋白对靶位点的剪切。sgRNA 序列较短，便于设计和载体构建，CRISPR/Cas9技术的这一特性，使其构建简便、易操作和高效率，也推动了该技术的广泛应用[22-25]。本研究将利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，靶向敲除AtPHO2 基因，获得新的crispr-Atpho2 突变体，并分析基因表达和其对磷代谢的影响，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在作物遗传改良方面提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与生长环境

本研究所用植物材料为拟南芥Col-0 生态型。拟南芥种子先用75% 的乙醇预消毒3 min，再用10% 次氯酸钠消毒10 min，最后用无菌水清洗3～5次，点播于1/2 MS培养基，4 ℃条件下春化3 d，然后置于植物培育箱，在24 ℃光照16 h和20 ℃黑暗8 h条件下进行培养。子叶完全展开时移栽到营养土中，置于人工气候室，生长条件为21 ℃光照14 h和19 ℃黑暗10 h 。本研究所用大肠杆菌菌株DH 5α由作者保存。CRISPR载体pHSN401及农杆菌菌株GV3101由中国农业大学陈其军等[26-27]提供(图 1)。

注：A，CRISPR/Cas9载体pHSN401；B，拟南芥转化辅助质粒pSoup；C，AtPHO2-CRISPR/Cas9重组载体构建示意图。

Notes: A, CRISPR/Cas9 vector pHSN401; B, Helper plasmid ofArabidopsistransformation; C, The diagram ofAtPHO2-CRISPR/Cas9 recombinant vector.

图1AtPHO2-CRISPR/Cas9基因编辑载体及重组载体构建示意图
Fig.1Geneeditingvectorandthediagramofrecombinantvector

1.2 AtPHO2-CRISPR/Cas9 植物双元表达载体的构建及拟南芥遗传转化

sgRNA由靶位点序列和sgRNA scaffold两部分组成，sgRNA scaffold序列是一段特殊结构的小RNA；而靶位点序列的组成结构为5′-AN19NGG-3′(N代表任意碱基)，sgRNA 特异识别靶基因中的NGG序列并引导Cas9蛋白对靶基因酶切。为提高CRISPR/Cas9基因组编辑技术的基因编辑效率，根据以下原则设计靶位点序列：靶位点序列在PAM 位点上游约20 个碱基；GC含量为50%～65%；Tm值在50～60 ℃，且正/反义链的Tm相差不超过3 ℃；靶位点在基因或功能域的5′端；不含特殊结构[26]。通过Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/)对所设计的靶位点序列进行特异性检测，筛选到AtPHO2高度特异的靶位点序列。然后，在靶序列及其互补序列的的5′分别添加attg和aaac，得到靶向敲除AtPHO2载体构建的引物序列。根据基因编辑靶位点序列分别设计PCR检测引物、转基因阳性苗检测引物、基因突变位点检测引物和基因表达定量引物(表1，在北京奥科鼎盛生物科技有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成与测序)。

AtPHO2-CRISPR/Cas9植物双元表达载体构建(图 1 C)。首先，靶位点序列的正/反向引物等量混合，65 ℃保温5 min，退火生成5′分别含有黏性末端的双链DNA片段。同时，用限制性内切酶BsaI(NEB)对pHSN401载体进行酶切(酶切体系如表 2 )。然后，纯化的酶切产物与退火生成的双链DNA片段进行连接(表3)。连接反应产物转化大肠杆菌，挑取单克隆，PCR扩增法及测序法鉴定重组子，采用冻融法[28]将阳性重组子转化农杆菌GV3101，并进行菌落PCR验证。GV3101在含有Kan 50 mg·L-1，Rif 30 mg·L-1，Tet 20 mg·L-1

(上海生工生物)3 种抗生素的LB培养基上划线培养2 d，收集农杆菌并将菌液稀释至OD600≈0.8，以备植物遗传转化。用收集的菌液侵染盛花期拟南芥花序[22]，待荚果完全成熟，收获转基因种子(T0)。T0代种子在含抗生素潮霉素(Hyg，30 mg·L-1；Roche)的1/2 MS 培养基上进行筛选，阳性单株移栽到基质中进行温室培养和表型鉴定。

表1 AtPHO2-CRISPR/Cas9植物双元表达载体构建及鉴定引物Table 1 The primer sequences of construction and identification of AtPHO2-CRISPR/Cas9

表2 pHSN401-BsaI酶切体系Table 2 The reaction system for pHSN401-BsaI restriction enzyme cutting

表3 AtPHO2-CRISPR/Cas9双元载体构建的连接体系Table 3 The reaction system for AtPHO2-CRISPR/Cas9 binary vector ligation

1.3 crispr-Atpho2 突变体的筛选与突变体鉴定

利用CTAB法提取crispr-Atpho2 突变体及野生型拟南芥叶片基因组DNA[29]，通过PCR扩增的方法筛选阳性突变体。然后，对阳性突变体及野生型进行PCR 产物测序，鉴定AtPHO2的突变类型。

参照BARI等[13]荧光定量PCR方法分析crispr-Atpho2突变体和野生型中AtPHO2 的表达差异。利用Trizol法(康为世纪)分别提取苗龄为生长50 d的突变体及野生型植株新生叶片的总RNA，以备qRT-PCR分析。采用反转录试剂盒TARAKA PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TARAKA)对提取的总RNA 进行反转录，合成cDNA；以合成的cDNA为模板，以actin2为内参，对AtPHO2 基因进行荧光定量分析。荧光定量PCR在BioRad CFX96TM(BioRad)荧光定量PCR仪上运行：95 ℃, 10 min→95 ℃, 15 s;60 ℃, 30 s;39个循环→95 ℃, 5 s→65 ℃, 5 s → 95 ℃, 5 s→4 ℃保温。每个样品3 次重复，用2-ΔΔCt法计算AtPHO2相对表达量。

植物组织无机磷含量测定参照AMES等[30]及CHIOU等[31]改进的钼酸铵法进行，分析生长35 d和50 d的crispr-Atpho2突变体及野生型的无机磷含量。取新鲜的地上部分，在液氮中充分研磨，用于无机磷含量测定。每个材料设置5个生物学重复，3个技术重复。

2 结果与分析

2.1 植物AtPHO2-CRISPR/Cas9双元表达载体构建与验证

本研究对AtPHO2 进行序列分析，在外显子区段筛选到5个候选靶位点，经过Cas-OFFinder 对候选靶位点序列的特异性分析，位于AtPHO2UBC结构域的3′端的1个候选靶位点序列较为合适，5′端分别添加BsaI的黏性末端，作为sgRNA的靶位点序列(表 1)。

靶位点序列的正/反向引物经过退火复性，生成双链DNA 片段，通过T4DNA连接酶与BsaI酶切产物BsaI-pHSN401 进行连接，并转化大肠杆菌。挑取大肠杆菌单克隆，经过特异性引物pHSN401_VF/R检测，结果表明，所挑取的6个单克隆均为阳性，其靶位点序列已经与载体CRISPR/Cas9发生了重组(图2A)。重组载体的质粒测序及序列分析表明，构建的载体是正确的，靶位点序列已插入到载体pHSN401(图2B)。重组载体的质粒-80 ℃条件下保存，以备用于农杆菌GV3101转化。

标注：A ,菌落PCR；V，表示空载体；泳道1～6表示菌落PCR。B,PCR测序，下划线部分表示AtPHO2基因靶的gRNA序列。M，2kb DNA标记。

Notes: A, Colony PCR； V, vector; Lanes 1 to 6, colony PCR. B, sequence of PCR, gRNA sequence ofAtPHO2 gene is under lined. M, 2kb DNA marker.

图2AtPHO2-CRISPR/Cas9重组载体鉴定
Fig.2IdentificationofAtPHO2-CRISPR/Cas9recombinantbinaryvector

注：M，2kb DNA；泳道1，质粒转化GV3101；泳道2，重组质粒。

Notes: M, 2kb DNA marker; Lane 1, Transformed GV3101; Lane 2, Recombination plasmid.

图3AtPHO2-CRISPR/Cas9重组质粒转化农杆菌鉴定

Fig.3IdentificationofAtPHO2-CRISPR/Cas9recombinantplasmidagrobacteriumtransformation

2.2 AtPHO2-CRISPR/Cas9双元表达载体的拟南芥遗传转化与crispr-Atpho2 突变体筛选

AtPHO2-CRISPR/Cas9双元表达载体利用冻融法转化的农杆菌经过抗性筛选，挑取单克隆，进行菌落PCR 检测。检测结果表明，所挑取的1 个单克隆中AtPHO2-CRISPR/Cas9重组子已成功导入农杆菌中(图 3)，可以用于拟南芥侵染。

重组子AtPHO2-CRISPR/Cas9转化农杆菌后，利用农杆菌介导的花序浸染法进行拟南芥遗传转化。遗传转化获得的T0代种子，在1/2 MS培养基上进行潮霉素抗性筛选。移栽获得的阳性转基因植株并放置于人工气候室培养，用于阳性转基因植株的突变位点、突变类型及表型鉴定。通过对转基因阳性植株的PCR 产物测序，测序的转基因阳性植株包含2种突变体：一种是AtPHO2靶位点处插入1 个碱基(A)，2 条同源染色体均发生突变的纯合子Atpho2-2/7(图4A及表 4)；另一种是AtPHO2仅在2条同源染色体中的一条发生突变的杂合子。为了进一步鉴定突变体杂合子的突变类型，利用LIU 等[32]开发的CRISPR/Cas9 突变体序列分析工具DSDecode(http://dsdecode.scgene.com/)对杂合子突变体进一步分析，结果表明，杂合子Atpho2-3是由于反义链插入1 个碱基(A)(表 4)，正义链未发生突变；而杂合子Atpho2-5 的正义链与反义链分别插入1 个碱基(A)与2 个碱基(AG)(表 4)。

通过对crispr-Atpho2 突变体的表型分析发现，突变体与野生型在幼苗期叶片的颜色及生长状况的差异不明显。营养生长向生殖生长转变时期(35 d)，突变体植株部分叶片边缘出现了明显的黄化现象，野生型植株并未出现衰老的迹象(图4B)。生殖生长期(50 d)的突变体植株大部分叶片出现了较为严重的黄化及坏死等磷毒害现象，而野生型植株叶片则呈现轻微的黄化现象(图4B)。对生殖生长期突变体及野生型拟南芥相同叶位的叶片进行比较，同一叶位的叶片在突变体中黄化与坏死的症状明显比野生型严重(图4C)。

2.3 拟南芥AtPHO2表达量检测

荧光定量PCR 分析结果表明，野生型拟南芥中AtPHO2 的相对表达量约是杂合突变体的3倍，是纯合突变体相对表达量的10 倍；杂合及纯合突变体表达量与野生型相比，差异均达到极显著水平(图 5)。进一步对突变体中纯合子及杂合子AtPHO2 的表达量差异分析，结果表明，杂合子AtPHO2 的相对表达量约是纯合子的3倍，差异达到极显著水平(P<0.01)(图5)。

注：A，crispr-Atpho2 突变体与野生型(WT)的序列对比，红线表示PAM 位点；B，生长35 d和50 d拟南芥叶片磷毒害表型；C，生长50 d莲座叶磷毒害表型；1～7，表示不同叶位的拟南芥叶片。

Notes: A, Blast ofcrispr-Atpho2 mutant and wild type (WT) , red line indicate the PAM sequence; B, P toxic ofcrispr-Atpho2 mutant and WT at 35 and 50 d; C, P toxic phenotype of plant leaves at 50 d; 1 to 7, indicated the leaf position ofArabidopsis.

图4 拟南芥crispr-Atpho2突变体鉴定

注：下划线字母表示靶位点中插入的碱基。

Notes: The underlined letters indicate the inserted base in the target site.

2.4 拟南芥无机磷含量的测定

对拟南芥突变体和野生型叶片组织的无机磷含量进行测定，结果显示，生长35 d的拟南芥野生型叶片无机磷含量约为9 mol·g-1，crispr-Atpho2杂合以及纯合突变体叶片中无机磷含量分别为25和27 mol·g-1，是野生型叶片无机磷含量的3倍左右，差异均达到极显著水平(P<0.01)。生长50 d的野生型拟南芥叶片无机磷含量约为35 mol·g-1，crispr-Atpho2杂合以及纯合突变体叶片中无机磷含量分别为60和100 mol·g-1，是野生型叶片无机磷含量的2倍和4倍，差异均达到极显著水平(P<0.01)(图 6)。

图5 crispr-Atpho2 突变体AtPHO2相对表达量分析Fig.5 Detection of AtPHO2 gene expression in crispr-Atpho2 mutants

图6 crispr-Atpho2突变体与野生型拟南芥生长35和50 d时叶片无机磷含量测定Fig.6 Pi content of crispr-Atpho2 mutant and wild type Arabidopsis on 35 and 50 d

3 结论与讨论

本研究通过对野生型及crispr-Atpho2突变体的Cas9蛋白靶位点的基因组DNA的测序和表型分析，结果表明，crispr-Atpho2突变体叶片黄化及坏死等磷毒害相关表型可能是由于Cas9蛋白在AtPHO2的靶位点处进行了剪切，细胞在自我修复过程中发生插入突变引起的。进一步对crispr-Atpho2突变体及野生型拟南芥AtPHO2基因表达差异结果分析表明，crispr-Atpho2纯合突变体与杂合突变体及野生型拟南芥基因表达量差异极显著，可能是由于在突变体的基因AtPHO2靶位点中插入1 个碱基(A)，引起移码突变，最终引起突变体及野生型AtPHO2基因表达量的差异变化。通过对拟南芥crispr-Atpho2突变体及野生型2个生育时期新鲜叶片的无机磷含量的测定发现，crispr-Atpho2杂合以及纯合突变体的叶片无机磷含量是野生型的2～4倍。齐敏兴等[33]在研究供磷水平与苜蓿光合作用时发现，叶面积、叶片数和株高等都与植株的磷含量有关，当磷含量超过植物自身的磷元素需求量时会产生叶片黄化、坏死，抑制植株生长等磷过量毒害症状。这与本研究中拟南芥Atpho2突变体的表型相似。AUNG等[8]研究表明，磷元素在Atpho2突变体中大量积累是由于AtPHO2编码的泛素结合酶UBC24的第671个氨基酸发生了终止突变，即由色氨酸(TGG)转变为终止密码子(TAG)，最终导致UBC24失去功能。而AtPHO2是通过泛素化途径，调控下游基因磷酸盐转运蛋白，由于AtPHO2发生了突变，导致磷酸盐的吸收及转运不受调控，打破磷的代谢平衡，磷酸盐在地上部持续积累，引起植株早衰。本研究中，crispr-Atpho2突变体的第8 个外显子编码链插入了1个碱基(T)，使AtPHO2的阅读框发生移码突变，最终导致AtPHO2失去活性。野生型中AtPHO2编码907 个氨基酸，其中，第770个氨基酸是异亮氨酸，而crispr-Atpho2突变体的第770 个氨基酸发生异亮氨酸的同义突变，从第771 个氨基酸开始移码，并且在第784 个氨基酸由谷氨酸(GAG)转变为终止密码子(TGA)，造成AtPHO2的翻译过早终止，生成功能缺失的蛋白质。AtPHO2的表达受抑制，造成磷酸转运蛋白不能通过泛素化途径被降解。植株地上部分最终积累大量无机磷，加速了其衰老进程。

PHO2除了在植物磷代谢调控中起到关键作用。敲除或干扰PHO2的表达，在不同的植物会产生不同的影响。拟南芥中，过量施用磷肥或植株中积累大量磷元素，也会产生与本研究Atpho2突变体相似的黄化等早衰现象[34]。水稻中，敲除OsPHO2基因导致磷元素在地上部过量积累，生长发育延迟[35]。OUYANG等[35]在普通小麦中敲除TaPHO2-A1，低磷时能促进磷的吸收而增加小麦产量；高磷时对小麦产量没有明显影响，这就为小麦等作物新品种选育提供可靠的理论依据。此外，PHO2还与非生物胁迫相关。PACAK等[37]的结果显示，高温胁迫使大麦地上部分HvPHO2表达量降低，从而增加磷的吸收，并反馈调控磷代谢相关基因的表达来响应高温胁迫。KIM等[31]研究表明，AtPHO2可通过调控TWINSISTEROFFT(TSF)的表达来影响开花，但该调控途径同时受控于外界温度的变化。这不仅表明PHO2的生物学功能在单子叶与双子叶间存在差异，而且PHO2基因功能具有冗余性。

本研究成功地运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，产生了新的Atpho2突变体，为进一步研究PHO2在磷代谢精细调控、胁迫响应等方面的研究提供了新的突变体材料。

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GeneknockoutandfunctionalanalysisofAtPHO2byCRISPR/Cas9-inducedmutagenesis

WANG Zhaohui, SHI Chaonan, YANG Tianxiao，XUE Yadong, SUN Huwei, TANG Guiliang, ZHANG Zhanhui

(College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China)

We constructed CRISPR/Cas9-mediatedAtPHO2 knock-out vector, then transformed inArabidopsis. In the transgenic descendants, threeAtpho2 positive mutants were screened. In the transgenic mutant, the gene expression ofAtPHO2 was significantly down-regulated, only one in ten of the wild type. The phosphorus contents in mutants and in the wild types were tested, the results of which revealed that Pi gradually accumulated in the new leaves with the aging process. The leaf phosphorus contents of the mutantAtpho2 were 2～4 times for the wild type. The results implied that more phosphorus accumulated inAtpho2 mutants for the phosphorus metabolism blocking. Additionally,AtPHO2 is probably associated with abiotic stress through regulating phosphorus metabolism andArabidopsissenescence.

Arabidopsis; genome editing technology; CRISPR/Cas9; UBC24; phosphorus homeostasis

2016-12-30

省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室项目(39990002)

王钊辉(1989-)，男，河南鲁山人，硕士研究生，主要从事玉米遗传育种研究。

张战辉(1984-)，男，河南伊川人，讲师，博士。

1000-2340(2017)04-0554-07

Q 754

A

(责任编辑：常思敏)