白花泡桐茎和叶差异表达的cDNA-SRAP分析

茹广欣，周霜晴，朱秀红，刘小囡，王鋆瑞

(河南农业大学林学院，河南 郑州 450002)

白花泡桐茎和叶差异表达的cDNA-SRAP分析

茹广欣，周霜晴，朱秀红，刘小囡，王鋆瑞

(河南农业大学林学院，河南 郑州 450002)

以白花泡桐茎和叶为材料，利用cDNA-SRAP分子标记技术，对其进行基因表达的差异分析。从64对引物中筛选出25对扩增效果较好的引物对进行扩增，检测得到36个差异片段，2次PCR扩增重复率为66.8%。经挑选回收、克隆和测序，最终测得23条差异片段序列，长度主要在400～1 700bp之间。经BLASTX进行比对和功能分析，16条与已知功能基因有较高同源性，包含能量与代谢(34.78%)、蛋白质合成(8.70%)、细胞壁相关(4.35%)、信号传导与胁迫响应(8.70%)及复合影响(13.04%)等多个方面；7条与未知功能基因序列有较高同源性。

cDNA-SRAP；白花泡桐；差异片段；功能分析

泡桐是一种重要的速生经济林木，原产于中国，在林业经济中占有重要地位。研究其木材形成过程中的各项生长机制、生理变化、以及基因分子层面探索等，可以为泡桐林木生长发育探索提供有效数据。张云岭等[1]通过在不同种源泡桐试材中对全干密度进行测定、对比及分析，得到其差异显著的结果。茹广欣等[2]对泡桐不同无性系木材的木材干缩性、纤维长、纤维宽、木材颜色等性状进行了研究，表明其间也存在显著差异。邓敏捷等[3]在不同盐浓度下研究不同泡桐间生理生态的响应特征，并比较其耐盐性。此外，近年来，也有学者以转录组测序方式对泡桐进行比对研究[4-5]。但这些研究多偏重于不同泡桐间生理或分子的表达情况，对泡桐器官组织间基因表达量差异的研究尚未见报导，探究植物器官组织间差异表达基因，可以更有效地探索植物在生长发育过程中器官生长发育调控作用基因及特异表达的机理。cDNA-SRAP分子标记技术是一种以cDNA为模板条件下，进行SRAP扩增的转录基因组学的研究方法。自此方法出现以来，已多次应用在植物上。乔燕春等[6]按照其在枇杷属植物上建立的SRAP反应体系，对山楂的果肉、种核和种子进行基因表达差异分析，获得了较为清晰的差异条带。刘娟等[7]对不同类型大黄进行差异分析，得到这些差异基因主要与植物信号转导、物质转运及抗逆性有关。郭丹丹等[8]用60对引物筛选出与红花苞叶刺相关的基因片段，证实其可能参与了红花刺性状的形成，为红花无刺品种的选育工作提供了重要方向。近期在动物研究上也证实此分子标记行之有效[9-10]。作为一个研究差异表达基因的重要手段，其简便、重复性好、试验成本低，已被广泛应用[11]。但该技术在泡桐基因差异表达上尚未见实施，本试验采用cDNA-SRAP技术尝试对白花泡桐茎和叶进行差异分析，以期在分子层面上了解泡桐组织器官生长发育过程中的基因表达情况，为泡桐分子机理研究提供参数依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自河南农业大学三区试验田，所选材料为白花泡桐幼茎和幼叶，于液氮条件下取材速冻，并带回实验室保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 总RNA的提取和cDNA第一链的合成

将组织样品分别在液氮中充分研磨后，按照Total RNA Exractor(Trizol)试剂盒SK1312(生工生物工程(上海)股份有限公司)说明书步骤进行RNA抽提，利用分光光度计分析所提取的RNA浓度，并经琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，观察28S rRNA和18S rRNA的比值及RNA的完整性。采用AMV反转录酶，Oligo dT和随机引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)混合反转录引物，按照SK2445试剂盒操作说明进行cDNA第一链的合成。

1.3 PCR扩增及反应检测

PCR反应体系为10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，cDNA模板0.5 μL，dNTP 2.5 mmol·L-11 μL，Taq DNA polymerase 5 U·μL-10.2 μL，Forward primer 10 nmol·L-10.5 μL，Reverse primer 10 nmol·L-10.5 μL，加双蒸H2O至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，36 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃修复延伸10 min，4 ℃终止反应保存。将PCR产物(10 μL)加在2%琼脂糖凝胶点样孔，在110 V电压、196 mA电流下进行电泳约1.5 h。电泳液为TAE缓冲液。

1.4 差异片断的回收、克隆、测序

在琼脂糖凝胶上找到两次PCR扩增重复性、特异性较好的差异条带，参照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行切胶回收，以此回收片断为模板，使用相同的SRAP引物，在相同体系程序条件下进行2次PCR扩增，并将此次所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测回收片断是否为目的条带，进而将回收产物与pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)连接，转入感受态细胞中，经过蓝白斑筛选，挑选阳性克隆测序。

1.5 测序结果同源性比对分析

测序结果序列通过NCBI网站进行BLAST比对分析。

2 结果与分析

2.1 白花泡桐茎和叶RNA的提取

提取的RNA经分光光度计检测，OD260/OD280的值为1.9～2.0。经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图(图1)显示，28S rRNA和18S rRNA两条条带清晰完整，无拖尾现象，且28S rRNA条带亮度约为18S rRNA条带亮度的2倍，说明提取的RNA可以进行后续试验。

M:DNA marker;1，茎;2，叶。M:DNA marker;1，Stems;2，Leaves.

2.2 白花泡桐茎和叶的cDNA-SRAP差异显示

通过对预试验64对引物的检验，筛选出25对扩增效果较好、条带清晰的引物进行后续试验(表1)。以白花泡桐茎和叶不同组织类型的逆转录第一条链为模板，通过进行2次SRAP扩增分析，从中筛选出23条有明显差异表达的条带，扩增长度主要在400～1 700 bp(图2)，2次PCR扩增重复率为66.8%。得到的差异片段有只在其中1个模板上单独表达的片段，也有两模板之间较为明显表达量差异条带，其中叶特异表达序列6个，茎特异表达2个，2者之间表达量差异序列15个，推测其可能与茎和叶生长发育调控基因相关。

M:DNA marker; 1～7分别表示引物组合:F1R3、F1R4、F3R1、F3R2、F3R3、F4R3、F4R4。M:DNA marker; 1～7 show the primer combinations :F1R3、F1R4、F3R1、F3R2、F3R3、F4R3、F4R4.

编号Primercode正向引物(5’-3’)Forwardprimers(5’-3’)反向引物(5’-3’)Reverseprimers(5’-3’)F1R3TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGGTF1R4TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGTGF2R1TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGCAF2R2TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGACF2R3TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGGTF3R1TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGCAF3R2TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGACF3R3TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGGTF4R3TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGGTF4R4TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGTGF5R2TGAGTCCAAACCGGGAGGACTGCGTACGAATTGACF6R2TGAGTCCAAACCGGGGAGACTGCGTACGAATTGACF6R3TGAGTCCAAACCGGGGAGACTGCGTACGAATTGGTF7R2TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGACF7R3TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGGTF7R4TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGTGF8R3TGAGTCCAAACCGGGTCGACTGCGTACGAATTGGTF9R2TGAGTCCAAACCGGTACGACTGCGTACGAATTGACF10R3TGAGTCCAAACCGGTCAGACTGCGTACGAATTGGTF11R4TGAGTCCAAACCGGTGTGACTGCGTACGAATTGTGF12R3TGAGTCCAAACCGGTTGGACTGCGTACGAATTGGTF13R3TGAGTCCAAACCGGCGGGACTGCGTACGAATTGGTF13R4TGAGTCCAAACCGGCGGGACTGCGTACGAATTGTGF15R4TGAGTCCAAACCGGCAAGACTGCGTACGAATTGTGF16R1TGAGTCCAAACCGGCTTGACTGCGTACGAATTGCA

2.3 差异条带的回收、测序及序列分析

将重复性稳定性好的差异条带进行切胶回收，进行2次PCR扩增后，结果显示所回收条带为目的差异片断(图3)，通过产物与载体连接转化之后，挑选阳性克隆测序，所得测序结果通过BLAST比对分析序列(表2)，结果显示23条片段序列分为6类：蛋白质合成相关基因、细胞壁生物合成与修饰相关基因、信号传导与胁迫响应相关基因、能量与代谢相关基因、部分多重功能相关基因及未知功能基因[12-17](表3)。其中，1个是双组分系统(F3R1J1000)，在植物应对外界环境刺激和生长调节的信号转导过程中起重要作用；2个是关于细胞壁水解酶(F3R3Y700、F6R3Y1100)；1个是钙离子依赖的蛋白激酶(F5R2Y400)调控信号通路；1个是氨酰tRNA合成酶(F6R3J600)；1个是光系统反应中心Ⅱ D2蛋白(F3R3Y1100)；1个是叶绿体AtpA(F7R4Y800)；1个是光反应中心A1脱辅基蛋白(F8R3Y600)；1个是半胱氨酸脱硫酶(F15R4Y1700)可能参与植物茎和叶的衰老过程。

M:DNA marker;A、B、C、D分别代表引物F1R3、F3R1、F3R3扩增出的部分差异片断。M:DNA marker; A、B、C、D repectively represent partial differential fragments amplified by primers F1R3, F3R1, and F3R3.

编号Code序列长度/bpLengthofsequencesGenBank登录号GenBank accessionNO. 相似序列 Similarsequence 物种 Species E值 Evalue F1R3Y11001196AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F3R1J10001038SDW06046.1Two-componentsystem,OmpRfamily,phosphateregulonsensorhistidinekinasePhoRHydrobacterpenzbergensis2e-133F3R3Y700752AGV54820.1Cellwall-associatedhydrolasePhaseolusvulgaris7e-77F3R3Y11001204ALN96514.1photosystemIIproteinD2(chloroplast)Castanopsisconcinna0.0F4R4J600684XP_013442963.1Senescence-associatedprotein,putativeMedicagotruncatula1e-110F5R2Y400397AHA61365.1Calcium-dependentproteinkinaseArachishypogaea7e-22F6R3J600628SDW23636.1Tryptophanyl-tRNAsynthetaseHydrobacterpenzbergensis9e-107F6R3Y11001253SDW74997.1AlphagalactosidaseAHydrobacterpenzbergensis0.0F7R2Y1000963YP_173415.1HypotheticalproteinNitaMp073Nicotianatabacum2e-36F7R2J550539XP_013442963.1Senescence-associatedprotein,putativeMedicagotruncatula1e-102F7R3Y11001211AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F7R4Y800780YP_009270897.1AtpA(chloroplast)Perillasetoyensis2e-163F8R3J800791AGC78890.1Hypotheticalprotein(mitochondrion)Viciafaba1e-103F8R3Y600593CCQ48570.2PhotosystemIP700chlorophyllaapoproteinA1Dicentraeximia1e-124F2R2J800773SDX40875.1RibonucleaseBN,tRNAprocessingenzymeHydrobacterpenzbergensis0.0F2R2J10001010WP_026769529.1HypotheticalproteinAsinibacteriumsp.OR530.0F2R3Y12001196AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F9R2J10001014WP_026769529.1HypotheticalproteinAsinibacteriumsp.OR530.0F10R3Y700678YP_001109497.1HypotheticalproteinPoptr_cp018Populustrichocarpa2e-40F12R3Y12001210AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F13R3J700694XP_013442971.1Senescence-associatedprotein,putative,partialMedicagotruncatula2e-104F13R4J800830XP_017630340.1UncharacterizedproteinGossypiumarboreum4e-153F15R4Y17001167SDX53024.1CysteinedesulfuraseHydrobacterpenzbergensis6e-148

表3 泡桐茎和叶差异表达基因的功能分类Table 3 Functional classification of genes expression in stems and leaves of Paulownia

3 结论与讨论

对于他类可用于差异基因筛选的分子技术而言，cDNA-SRAP分子标记技术在同样保持稳定性好、条带丰富的前提下，操作程序更为简便，相对来说对仪器设施等要求亦不高，试验成本更少；且试验操作不仅适用于同种之间差异表达分析，同样适用于不同种之间或者同一植株、不同组织之间等多个样本同时差异分析，近年来已广泛应用于基因差异表达研究上[18-20]。在本试验过程中，为避免假阳性结果的过多出现，在严谨操作步骤、操作手法的同时，采取重复操作试验措施，另外，由于试验采用琼脂糖凝胶电泳成像系统，以肉眼观测来评判和筛选所得到的差异结果，存在一定主观性，不能完整完善地获取所有有效信息，这些皆是分子试验中可能存在的弊端，在试验操作中，可以与其他分子标记技术相结合的方式进行生物学信息探索。

本试验以白花泡桐幼茎和幼叶为研究材料，采用cDNA-SRAP分子技术方法，来探究泡桐生长初期组织器官间的差异表达，最终获得在白花泡桐茎和叶间的差异表达片段中16条与已知功能基因同源性比较高的序列和7条未知功能基因的序列，包含能量与代谢、蛋白质合成、细胞壁相关、信号传导与胁迫响应及复合影响等多个方面，推测这些基因可能参与泡桐茎和叶生长发育及调控过程，且部分基因在茎和叶组织器官间有明显表达量差异，表明了cDNA-SRAP技术在对白花泡桐差异分析试验上的可行性，从中获得的生长调控相关基因可进一步用于生长机制分子机理研究，同时可扩大差异分析体系以检测更多有效片段序列，为确定所得差异表达基因的准确相关性，使用Quantitative Real-time PCR或其他功能验证进一步检测确定结果。

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DifferentialexpressionanalysisofstemandleafinPaulowniafortuneibycDNA-SRAP

RU Guangxin，ZHOU Shuangqing，ZHU Xiuhong，LIU Xiaonan，WANG Yunrui

(College of Forestry，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

The stem and leaf ofPaulowniafortuneito analyze the differential gene expression with the method of cDNA-SRAP. Among the 64 pairs of primers, 25 pairs of primers were screened with good amplification effect, and 36 differential fragments were detected. The repetition rate of the two times PCR amplification was about 66.8%. After being selected, cloned, and sequenced, 23 fragments of the differential sequence were measured, and the length was between 400 and 1 700bp.According to the genomic database, sequence analysis showed that 16 fragments have significant homologous nucleotide sequence and 7 fragments with unknown function gene sequence has high homology.

cDNA-SRAP;Paulowniafortunei; differential fragments; functional analysis

2017-03-13

国家科技支撑计划专题(2013BAD01B06)；大学生创新创业训练计划(1402103020)

茹广欣(1963-)，男，河南洛阳人，教授，博士，主要从事为林木遗传育种方面的研究。

朱秀红(1966-)，女，河南信阳人，教授。

1000-2340(2017)04-0481-06

S 722

A

(责任编辑：李 莹)