实时定量检测NF-κB p65亚基核易位方法的建立

贾俐莉，王小利，杨怡姝，沈思嗣，曾毅

北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124

实时定量检测NF-κB p65亚基核易位方法的建立

贾俐莉，王小利，杨怡姝，沈思嗣，曾毅

北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124

目的：建立可直观检测NF-κB p65亚基核易位的方法。方法：构建NF-κB p65的真核表达重组质粒pEG⁃FP-p65，转染HeLa细胞，加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）后采用活细胞成像技术观察绿色荧光蛋白在HeLa细胞内的变化。结果：TNF-α处理后0～2 h，EGFP-p65融合蛋白主要聚集在胞浆处；TNF-α处理后4～12 h，随处理时间的延长，细胞核处的绿色荧光蛋白逐渐增强，但细胞内总荧光值基本保持稳定。结论：TNF-α可以促进EGFP-p65入核。活细胞成像技术具有操作简单、实时动态、直观、定量等优点，可用于探讨人类免疫缺陷病毒（HIV）潜伏感染再激活剂的作用机制。

NF-κB；肿瘤坏死因子α；活细胞成像；核易位

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）在体内的潜伏感染是无法治愈艾滋病的重要原因[1-2]。HIV-1原病毒的整合位置、表观调控、RNA聚合酶起始复合体的形成、反式激活因子的作用等环节参与了HIV-1潜伏感染的建立与再激活过程。采用蛋白激酶C（protein ki⁃nase C，PKC）激活剂活化 NF-κB通路再激活HIV-1潜伏感染，是当前“激活再杀伤（shock and kill）”治疗策略的一个研究方向[2-4]。

NF-κB是细胞核内重要的转录因子，HIV-1长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）中存在2个NF-κB结合位点。各种刺激因子诱导NF-κB易位至细胞核，可有效激活HIV-1[5]。TNF-α可以活化NF-κB[6]，本课题组前期研究显示，2.5 ng/mL TNF-α对HIV潜伏感染模型J-Lat 11.1有明显的再激活作用，再激活率达51.78%。在此，我们拟采用活细胞成像技术观察TNF-α对NF-κB p65的核易位作用，并探讨该方法在HIV-1潜伏感染再激活剂作用机制研究中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

J-Lat 11.1细胞由美国加州大学医学系Eric Verdin教授馈赠；人宫颈癌细胞株（HeLa）、质粒pEGFP-C3为本实验室保存；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、RPMI1640培养基购自Gibco公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞、限制性内切酶、ExTaq酶、T4DNA连接酶、DNA marker、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒和RNA反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；玻璃底细胞培养皿（直径20 mm）购自NEST公司；FuGENE6转染试剂购自Promega公司；引物合成及测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 真核表达质粒pEGFP-p65的构建

TRIzol法提取J-Lat 11.1细胞总RNA，逆转录成cDNA作为模板。根据人NF-κB p65基因序列（GenBank登录号：223468675）的CDS区设计上游引物（5'-CTCGAGATGGACGAACTGTTCCC-3'，下划线序列为XhoⅠ酶切位点）和下游引物（5'-GG ATCCTTAGGAGCTGATCTGAC-3'，下划线序列为BamHⅠ酶切位点），扩增片段长约1660 bp。扩增产物及质粒pEGFP-C3分别经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，回收相应目的片段，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒进行双酶切及测序鉴定。

1.3 细胞培养

HeLa细胞用含10%FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞成层后用0.25%胰蛋白酶消化传代。J-Lat 11.1细胞为悬浮细胞，用含10%FBS的RPMI1640培养。

1.4 质粒转染及重组融合蛋白观察

将HeLa细胞以3×105/孔接种至六孔板，培养24 h后，参照转染试剂说明书将重组质粒和Fu⁃GENE6按1∶10（m/v）的比例进行转染，转染24 h后弃上清，加入2 mL 4%甲醛固定，轻摇混匀后室温放置15 min，PBS洗涤3次，加入1 mL DAPI染液，室温染色5 min，吸弃DAPI染液，PBS洗涤3次，加入2 mL PBS，在蔡司倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。

1.5 活细胞成像观察EGFP-p65融合蛋白的移位

将HeLa细胞以上述方法接种并转染至玻璃底细胞培养皿中，培养24 h后更换新鲜培养基2 mL，加入 TNF-α，使其终浓度为 0或 10 ng/mL。将培养皿放置到活细胞成像的细胞培养室，打开Axio Vision Rel4.8软件，选取适宜视野，点击“Multidimensional Acquisition”菜单后出现实验参数设置对话框：在荧光检测通道“C”菜单中，选择“GFP”通道采集绿色荧光信号，并设置曝光时间为400 ms；在纵向检测距离“Z”菜单中，设置检测层数为15层，并设置Z轴上的起止焦平面位置；在检测持续时间“T”菜单中，设置信号采集间隔时间为5 min，连续检测24 h；之后点击“Start”按钮，开始动态检测绿色荧光信号。观察结束后，点击“Resample”按钮选择第0、1、……、24 h时间点的图像，输出该系列图像；点击“CutView”菜单，使各层荧光信号叠加，点击“Create TL image”输出每小时的正交显示图像；通过“Outline”工具选中细胞核区域或整个细胞的区域，单击鼠标右键选择“Properties”，在“Measurement”菜单中选中“AllT”，输出选中区域灰度值表，导出数据用Prism软件分析。

2 结果

2.1 pEGFP-p65重组质粒的鉴定

图1显示RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，扩增条带位于1500～2000 bp；pEGFP-p65重组质粒经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切得到2个片段，大片段位于 3000～5000 bp，小片段位于 1500～2000 bp，与预期结果相符。将重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序后与GenBank数据库中的NF-κB p65序列比对，结果一致（序列略）。

图1 pEGFP-p65重组质粒的鉴定

2.2 EGFP-p65融合蛋白的表达

将pEGFP-C3空载体、pEGFP-p65重组质粒分别转染HeLa细胞24 h后，采用DAPI对细胞核进行染色。由图2可见EGFP弥散分布在HeLa细胞的胞浆和胞核中，而EGFP-p65融合蛋白则主要分布在胞浆内。

图2 EGFP和EGFP-p65融合蛋白在HeLa细胞中的表达（×20）

2.3 TNF-α对NF-κB p65亚基核易位的影响

pEGFP-p65重组质粒转染HeLa细胞24 h后，未经TNF-α处理组连续观察24 h，绿色荧光始终分布在胞浆中（图3），且细胞内的总荧光值和细胞核内荧光值均基本保持稳定（图4），提示EGFP-p65融合蛋白亚细胞定位未发生明显变化。

图3 对照组EGFP-p65融合蛋白的动态表达过程（×40）

图4 对照组EGFP-p65融合蛋白荧光值动态变化情况

经TNF-α处理0～2 h，绿色荧光主要聚集在胞浆处；随着处理时间的延长，细胞核处的绿色荧光逐渐增强（图5）。12～16 h时细胞#1的绿色荧光消失，16～20 h时细胞#3的绿色荧光消失，20～24 h时细胞#2的绿色荧光消失。图6显示TNF-α处理后0～12 h细胞内的总荧光值无明显变化，基本维持在一个较高且稳定的水平；但细胞核内的荧光值不断升高，由0 h的13 035.96逐渐升高至12 h的54 298.44，升高了3.17倍，提示TNF-α促进EGFP-p65由胞浆处易位至胞核。自13 h后细胞内EGFP-p65融合蛋白总荧光值和细胞核内的荧光值均逐渐下降，该数据与图5中发出绿色荧光细胞的消失现象相呼应。推测出现这种现象的原因是NF-κB p65过表达且大量易位至细胞核，激活了细胞中多种依赖NF-κB通路基因的表达，对细胞造成了破坏，导致细胞死亡。

图5 TNF-α处理组EGFP-p65融合蛋白的动态表达过程（×40）

图6 TNF-α处理组EGFP-p65融合蛋白荧光值动态变化情况

3 讨论

由于HIV-1潜伏病毒库的存在，使得现行有效的高效抗逆转录疗法（highly active anti-retrovi⁃ral therapy，HAART）亦不能彻底清除 HIV-1感染，因此近年来艾滋病的治疗目标逐步转为“功能性治愈”，即经过治疗后，不必采用联合抗病毒治疗仍可长期抑制HIV-1的复制[1]。为实现这一目标，如何减少潜伏感染的细胞储存库是亟须解决的一个问题。目前HIV-1的潜伏感染再激活的研究主要集中在使用组蛋白乙酰化酶抑制剂、DNA甲基化抑制剂、PKC激活剂等来激活潜伏感染的HIV-1，联合使用HAART抑制子代病毒的产生，或调动机体免疫系统清除活化的感染细胞。本课题组前期筛选到一些可以显著再激活JLat11.1的天然植物提取物，采用PKC抑制剂或NF-κB抑制剂可阻断其再激活作用。为进一步明确这些天然植物提取物是否可以引起NF-κB核易位，进而活化病毒LTR，本研究以TNF-α为例，建立了NF-κB核易位的直观检测体系。

目前关于NF-κB核易位的研究方法主要是分别在不同时间点提取核蛋白或总蛋白，采用Western印迹技术检测细胞核内NF-κB p65水平的变化[7-9]。该方法操作复杂、步骤繁琐，影响因素较多，不易质控且不易定量，从而导致实验结果不理想。本研究建立的活细胞成像方法具有下列优点：①活细胞成像技术操作简单，选定待观察视野后，只须在软件中设置检测参数，无须对样本进行多种处理；②该方法可以实现实时动态观察，本研究设定每隔5 min采集信号，24 h内共采集了289个信号，这是Western印迹无法比拟的；③荧光成像图像可以直观地显示融合蛋白的所在位置，并且可以通过荧光信号值定量分析核内与细胞内的总荧光值的变化趋势；④确定观察视野后，既可分析视野里全部目标细胞的荧光蛋白变化情况，又可分析单个细胞的荧光蛋白变化情况，可对目标细胞进行纵向的动态追踪；⑤活细胞成像技术不必经过蛋白抽提、蛋白电泳、抗体孵育等环节，引入的操作误差小，易于质控。但是，该技术也存在仪器成本高、观察视野有限、待观察蛋白需要有荧光标记等不足。

综上，本研究采用活细胞成像技术直观地观察到TNF-α促进EGFP-p65融合蛋白的核易位过程，该技术可用于评价HIV-1潜伏感染再激活剂是否通过NF-κB通路发挥作用，亦可应用于其他蛋白亚细胞定位变化的研究中。

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Establishment of Real-Time Quantitative Method Detecting the Nuclear Translocation of NF-κB p65

JIA Li-Li,WANG Xiao-Li,YANG Yi-Shu*,SHEN Si-Si,ZENG Yi
College of Life Science and Bio-Engineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China

Objective:To establish a feasible method that visualized EGFP-p65 fusion protein nuclear transloca⁃tion.Methods:Recombinant pEGFP-p65 was constructed,then transfected into HeLa cells.Live cell imaging was adopted to observe the subcellular localization of green fluorescent protein.Results:EGFP-p65 fusion protein main⁃ly exists in the cytoplasm from 0～2 h after TNF-α treatment.The signals of green fluorescence in the nucleus gradually increased from 4～12 h,while the total fluorescent intensity in cells remained unchanged.Conclusion:TNF-α can promote the nuclear translocation of EGFP-p65 fusion protein.The technique of live cell imaging has many advantages over other methods such as simple operation,real-time dynamic,intuitive and quantitative,which can be applied to probe the mechanism of HIV latency reactivators.

NF-κB;TNF-α;live cell imaging;nuclear translocation

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）05-0676-05

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:yishu-y@bjut.edu.cn

2017-03-30

国家科技重大专项（2014ZX10005-002）；抗病毒药物北京市国际科技合作基地项目

贾俐莉（1992- ），女，硕士研究生，（E-mail）jialili2017@qq.com

杨怡姝，（E-mail）yishu-y@bjut.edu.cn