人G3BP1真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的定位分析

张丽娜，黄映辉

北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124

人G3BP1真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的定位分析

张丽娜，黄映辉

北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124

目的：构建GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白1（G3BP1）的真核表达载体pEGFP-C3-G3BP1，并观察其在人食管癌EC109细胞中的表达及定位。方法：采用RT-PCR法从EC109细胞中扩增G3BP1 cDNA全长序列，用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切PCR产物后克隆至pEGFP-C3载体，转化大肠杆菌DH5α后，挑取阳性克隆提取质粒，经双酶切及测序鉴定；将重组质粒用脂质体法转染EC109细胞，荧光定量RT-PCR和Western印迹检测G3BP1的表达，荧光显微镜观察G3BP1的定位。结果：目的基因G3BP1的序列完全正确，并在EC109细胞中获得表达，荧光显微镜观察显示G3BP1定位于细胞质。结论：构建了pEGFP-C3-G3BP1真核表达载体，并在EC109细胞中过表达，G3BP1蛋白定位于细胞质，形成应激颗粒（stress granules，SGs）。为进一步探讨G3BP1在食管癌细胞中的功能及其与SGs的相关性奠定了基础。

GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白1（G3BP1）；EC109细胞；细胞定位；应激颗粒（SGs）

GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白1（Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding pro⁃tein 1，G3BP1）是由Parker等通过免疫共沉淀分离到的第一个RasGAP SH3结构域结合蛋白[1]。G3BP1的相对分子质量为68 000，在进化过程中高度保守，属于RNA结合蛋白家族，在调控Ras信号转导过程中起重要作用[2]。哺乳动物细胞中至少存在2种形式的G3BP，即G3BP1和G3BP2。许多证据表明G3BP1具有多种生物学功能，参与细胞生长、转移、分化、凋亡和RNA代谢等过程。

研究表明G3BP1在多种肿瘤组织和细胞中高表达，包括头颈部癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等，而且与肿瘤的侵袭转移相关[3-6]，这暗示G3BP1可能是一种肿瘤标志物。食管癌是消化系统中一种常见的肿瘤，严重危害人类的身体健康。寻找其有效的基因靶点抑制食管癌细胞的生长转移并进行深入的功能研究，对于提高食管癌患者的生存率和改善食管癌治疗具有重要意义。但目前关于G3BP1与食管癌发生发展之间的关系尚不清楚，相关研究报道很少。此外，研究证实在细胞中过表达G3BP1可诱导胞质中形成应激颗粒（stress granules，SGs）[7]。SGs是细胞应对各种毒性刺激反应时在胞质内形成的一种比较大的颗粒，在应激反应时对mRNA代谢起关键调控作用，但细胞中过表达G3BP1形成SGs的具体机制也不是很清楚。

蛋白的亚细胞定位情况往往与其功能密切相关，因此，我们通过分子生物学手段构建了带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的pEGFP-C3-G3BP1真核表达载体，然后转染食管癌EC109细胞，检测其在EC109细胞中的表达，并观察其在EC109细胞中的定位，阐明G3BP1的亚细胞定位特点，为后续的功能及作用机制研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

EC109细胞来源于美国ATCC细胞库，由本实验室传代培养；pEGFP-C3真核表达载体为本实验室保存；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、0.25% Trypsin-EDTA 和 100×Penicillin-Streptomy⁃cin Solution双抗购自Hyclone公司；转染试剂Li⁃pofectAMINE 2000购自Invitrogen公司；限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ及T4DNA连接酶购自NEB公司；DNA marker（DL2000和 DL15000）、质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳胶回收及纯化试剂盒和大肠杆菌感受态细胞DH5α均购自天根生化科技（北京）有限公司；BCA蛋白定量试剂盒和RIPA裂解液购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；G3BP1抗体购自GeneTex公司；β-actin抗体购自Cell Signaling Technology（CST）公司；HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗购自ABGENT公司；PCR扩增酶Ex Taq、cDNA逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Di⁃mer Eraser购自大连宝生物工程有限公司；PVDF膜和ECL化学发光底物购自Millipore公司；PCR扩增引物在上海生物工程公司合成。

1.2 G3BP1基因特异性引物设计

根据NCBI网站的人G3BP1基因碱基序列，用Primer Premier 5软件设计针对G3BP1 ORF的特异性扩增引物。上游引物为5′-GCCCAAGCTTA TGGTGATGGAGAAGCC-3′（划线处为HindⅢ酶切位点），下游引物为 5′-ATACGGATCCTCACTGCC GTGGCGCAA-3′（划线处为BamHⅠ酶切位点）。分别在上、下游引物的5′端加上了HindⅢ和BamHⅠ酶切位点及4个保护碱基，扩增1401 bp的人G3BP1全长cDNA序列。

1.3 RT-PCR扩增G3BP1基因

用RNA提取试剂盒提取人食管癌EC109细胞中的总RNA，取1 μg RNA，根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。以此为模板，PCR扩增G3BP1的ORF序列1401 bp。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃再延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片段，按照琼脂糖凝胶电泳胶回收及纯化试剂盒说明书进行纯化回收。

1.4 pEGFP-C3-G3BP1重组质粒的构建与鉴定

将pEGFP-C3载体与G3BP1基因PCR回收产物分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，37℃酶切4 h；琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收线性载体和目的基因片段；在T4DNA连接酶作用下，将pEGFPC3和G3BP1目的片段于16℃反应2 h，然后将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30 min，42℃热激90 s，立即转入冰中静置5 min，加入无抗LB 培养基800 μL，在 37℃摇床上振荡培养1 h（200 r/min），最后将菌液均匀涂布在含卡那霉素的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。从转化平板上随机挑取单菌落，用G3BP1克隆引物进行菌落PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性克隆菌落扩大培养，用质粒小提试剂盒提取重组质粒pEGFP-C3-G3BP1，阳性克隆经双酶切鉴定后测序，测序正确后进一步扩大培养，大量提取重组质粒DNA。

1.5 EC109细胞培养、转染及荧光观察

6孔板的各孔接种2×105EC109细胞，放入5%CO2、37℃培养箱中培养24 h，使细胞达到对数生长期，转染时细胞密度达70%～80%。将6孔板中含10%胎牛血清的DMEM培养基更换为无血清的DMEM培养基，用脂质体转染试剂Lipo⁃fectAMINE 2000将pEGFP-C3-G3BP1重组质粒和pEGFP-C3对照质粒转染至6孔板的细胞培养基中，继续培养4～6 h，将细胞培养液换成新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基，于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养48 h，倒置荧光显微镜观察GFP在EC109细胞中的分布。

1.6 荧光定量RT-PCR检测转染EC109细胞G3BP1 mRNA的表达

用0.25%胰酶消化收集转染了pEGFP-C3对照质粒和pEGFP-C3-G3BP1重组质粒的EC109细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，取1 μg RNA逆转录成cDNA，用荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Dimer Eraser检测，反应体系为20 μL（10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ，上、下游引物各 0.8 μL，0.4 μL Rox Reference DyeⅡ，ddH2O 6 μL，2 μL cDNA模板），混匀，放入Strat⁃agene MX3005P荧光定量PCR仪中进行扩增。扩增条件：95℃热激活 5 min，95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。G3BP1上游引物序列为 5′-ATGCAGTCTACGGACAGAAAGA-3′，下游引物序列为 5′-GAGCATCAACATGGCGAATCT-3′；内参GAPDH上游引物序列为5′-CGCTCTCTGCTCC TCCTGTT-3′，下游引物序列为 5′-ATGCAGTCTA CGGACAGAAAGA-3′。 通 过 2-ΔΔCt法 计 算 G3BP1 mRNA在EC109细胞中的相对表达量。

1.7 Western印迹检测转染EC109细胞G3BP1蛋白的表达

用0.25%胰酶消化收集转染了pEGFP-C3对照质粒和pEGFP-C3-G3BP1重组质粒的EC109细胞，加入RIPA全细胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，然后加入4×SDS缓冲液沸水煮10 min使蛋白变性。配制10%聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样40 μg总蛋白，100 V恒压电泳2 h，90 V恒压转膜1 h，然后用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h，分别加入G3BP1抗体（1∶1000）和 β-actin抗体（1∶5000），4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶6000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；加入ECL化学发光底物显色成像。

1.8 统计学分析

实验数据用GraphPad Prism 5统计学软件处理，2组间的统计比较采用t检验分析，P＜0.05时认为具有显著性差异。

2 结果

2.1 获取G3BP1基因全长序列

以食管癌细胞EC109的cDNA文库为模板，用G3BP1基因特异引物扩增出目的基因的完整ORF，经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段约为1400 bp，符合要求（图1）。

图1 G3BP1基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

2.2 双酶切及测序鉴定

重组质粒pEGFP-C3-G3BP1经HindⅢ和BamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定可见约5.0 kb的线性载体片段（未酶切的环状pEGFP-C3空质粒大小为4.7 kb）和1401 bp的目的片段，与PCR结果一致，表明目的片段插入成功（图2）。对重组质粒pEGFP-C3-G3BP1进行测序鉴定，测序结果比对发现与人G3BP1基因的ORF序列完全相同。

图2 pEGFP-C3-G3BP1重组质粒的HindⅢ/BamHⅠ双酶切电泳图谱

2.3 G3BP1在EC109细胞中的表达

将测序正确的重组质粒pEGFP-C3-G3BP1和对照质粒pEGFP-C3转染EC109细胞，48 h后消化收集细胞，分别提取总RNA和总蛋白。通过荧光定量RT-PCR检测G3BP1在EC109细胞中mRNA水平的表达，发现与转染对照质粒相比，G3BP1的表达水平显著升高，表达量升高大于100倍（图3A）。通过Western印迹检测G3BP1在EC109细胞中蛋白水平的表达，发现G3BP1的表达水平也明显增高（图3B）。说明pEGFP-C3-G3BP1重组质粒在EC109细胞中获得表达。

图3 G3BP1在EC109细胞中的mRNA和蛋白水平表达结果

2.4 G3BP1在EC109细胞中的定位

将测序正确的重组质粒pEGFP-C3-G3BP1和对照质粒pEGFP-C3转染EC109细胞，48 h后用倒置荧光显微镜观察拍照，绿色荧光代表GFP融合蛋白的亚细胞定位。结果发现在转染pEGFPC3对照质粒的细胞中，绿色荧光遍布整个细胞，且核质中分布比较均匀（图4A）；而转染pEGFPC3-G3BP1重组质粒的EC109细胞中，绿色荧光主要分布在细胞质中，细胞核中没有看到绿色荧光，即G3BP1与GFP的融合蛋白定位于细胞质。同时，还观察到30%左右转染成功的细胞中出现了弥散的绿色荧光颗粒分布，即形成了SGs（图4C）。上述结果表明在EC109细胞中过表达G3BP1会在细胞质中产生SGs，这与文献报道的在其他细胞中的研究结果一致，也进一步证明过表达G3BP1是应激颗粒的一个标志物。

图4 G3BP1在EC109细胞中的亚细胞定位（×200）

3 讨论

G3BP1作为第一个RasGAP SH3结构域结合蛋白，在Ras信号转导过程中起重要调控作用。越来越多的研究表明G3BP1具有多种生物学功能，参与细胞的增殖、转移、分化、凋亡、RNA代谢和诱导胞质中应激颗粒的形成[8-11]。早期研究表明G3BP1在多种肿瘤组织和细胞中高表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关。Zhang等[12]研究发现，在肺癌细胞H1299中下调G3BP1表达能通过抑制Src/FAK相关的信号通路来抑制肺癌细胞的生长、迁移和侵袭。同样，在结肠癌细胞HCT116中也发现下调G3BP1的表达抑制结肠癌细胞的生长，并能提高化疗药物的疗效[13]。在乳腺癌的研究中发现G3BP1能通过Smad信号通路参与上皮-间质转化（EMT）诱导的转移[14]。Dou等[15]在肝癌中的研究表明G3BP1通过上调Slug表达而促进肝癌转移。以上结果提示G3BP1与肿瘤的发生发展有关，可能是一个潜在的肿瘤治疗靶点。

蛋白的表达具有时间和空间特异性，大量研究显示蛋白质的功能与其亚细胞定位密切相关，因而阐明蛋白质在不同细胞或不同生理、病理状态下的定位情况，将为其功能研究提供重要线索和理论依据。G3BP1是一种胞质蛋白，主要定位于细胞质，Tourriere等[7]报道G3BP1蛋白在Cos和CCL39细胞内主要分布在细胞质中，核内未见明显表达，而且在胞质中形成应激颗粒。但G3BP1在肿瘤细胞中的定位与正常细胞中是否有差异，是否也会诱导肿瘤细胞胞质中形成SGs，这些问题有待深入研究。

我们构建了带有GFP标签的pEGFP-C3-G3BP1重组真核表达载体，分析G3BP1在食管癌EC109细胞中的表达和定位情况。荧光定量RTPCR和Western印迹结果表明G3BP1在EC109细胞中过表达，荧光显微镜观察显示转染pEGFPC3-G3BP1重组质粒的细胞内，绿色荧光主要分布在细胞质中，核内未见明显表达，而且有一部分细胞的胞质中绿色荧光呈斑点状分布，即形成了SGs。综上，我们构建了pEGFP-C3-G3BP1真核表达载体，证实G3BP1是胞质蛋白，能够诱导肿瘤细胞SGs的形成，但并不是所有成功转染的细胞中都形成SGs，可能是因为重组质粒的转染以及细胞处于不同发育周期而造成的差异。本研究为进一步探讨G3BP1在食管癌中的功能及其与SGs的相关性提供了途径和线索。

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Construction of the Eukaryotic Expression Vector for Hu⁃man G3BP1 Gene and Analysis of its Cellular Localization in Esophageal Cancer Cells

ZHANG Li-Na,HUANG Ying-Hui*
College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China

Objective:To construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-C3-G3BP1 and to inves⁃tigate the expression and cellular localization of Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding protein 1（G3BP1） in human esophageal cancer cell line EC109.Methods:The cDNA of G3BP1 was amplified from EC109 cells by RT-PCR method.The PCR products were digested with restriction endonucleasesHindⅢandBamHⅠ and subcloned into pEGFP-C3 vector.After transformation intoE.coliDH5α,the postive clones were picked for plasmid extraction and identified by double digestion and sequencing analysis.The recombinant plasmid was transfected into EC109 cells by liposome transfection method,and then the expression of G3BP1 was detected by fluorescence quantitative RT-PCR and Western blot analysis.The cellular localization of G3BP1 was observed by fluorescence microscopy.Results:The sequence of G3BP1 gene was correct and expressed in EC109 cells.G3BP1 was localized in the cytoplasm of EC109 cells.Conclusion:Eukaryotic expression vector pEGFP-C3-G3BP1 was constructed and expressed in EC109 cells.G3BP1 protein was mainly localized in the cytoplasm of EC109 cells and induced the formation of stress granules（SGs）.These findings can help to further study on the functions of G3BP1 in esophageal cancer cells and its correlation with SGs.

Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding protein 1（G3BP1）;EC109 cells;cellular local⁃ization;stress granules（SGs）

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）05-0623-06

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:yhuang@bjut.edu.cn

2017-02-20

北京市科委重点项目（Z151100003915073）；北京市博士后工作经费资助项目（2016ZZ-33）

张丽娜（1986- ），女，博士，讲师，（E-mail）lnzhang@bjut.edu.cn

黄映辉，（E-mail）yhuang@bjut.edu.cn