几种抗冻剂对达氏鲟精子活力及运动时间的影响

何 斌，陈彦伶，龙治海，严俊刚，赵凤麒，夏 美，陈先均*

(1.四川省农业科学院水产研究所，四川 宜宾 644000；2.四川省生物资源保护与可持续利用实验室，四川 成都 610041；3.贵州省石阡县畜牧产业发展中心，贵州 石阡 555100)

几种抗冻剂对达氏鲟精子活力及运动时间的影响

何 斌1,2，陈彦伶1，龙治海1，严俊刚1，赵凤麒1，夏 美3，陈先均1*

(1.四川省农业科学院水产研究所，四川 宜宾 644000；2.四川省生物资源保护与可持续利用实验室，四川 成都 610041；3.贵州省石阡县畜牧产业发展中心，贵州 石阡 555100)

【目的】为了研究不同浓度抗冻剂对达氏鲟精子活力、运动时间和寿命的影响，【方法】用0.7 %氯化钠+0.02 %氯化钾+3.5 %葡萄糖的稀释液分别配制成4 %甲醇(Methanol)、8 %乙二醇( Ethylene Glycol)、12 % 1,3-丙二醇(1,3-Propanediol)、16 %丙三醇(Glycerol)、20 %二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide)和24 %二甲亚砜(Dimethyl Sulfoxide)的6种抗冻剂，在4 ℃保存达氏鲟精子16 h后进行激活处理。【结果】结果表明：丙三醇、二甲基甲酰胺和二甲亚砜在浓度4 %～24 %时精子激活后有活力和寿命；甲醇、乙二醇和1,3-丙二醇在浓度4 %～16 %时精子激活后有活力和寿命，当浓度为20 %和24 %时精子全部死亡。甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇、丙三醇、二甲基甲酰胺和二甲亚砜浓度分别为8 %、8 %、12 %、4 %、4 %和8 %时，最高精子活力分别为81 %、32 %、76 %、64 %、72 %和67 %，最长精子激烈运动时间和寿命分别为42 和205 s、16 和123 s、36 和127 s、25 和96 s、27和132 s、25和103 s。甲醇与其它几种抗冻剂相比，在8 %甲醇中达氏鲟精子的激烈运动时间和寿命最长，分别为42和205 s。【结论】6种抗冻剂对达氏鲟精子有不同的毒性作用，保存后精子活力和寿命均降低。

达氏鲟；抗冻剂；精子活力；运动时间

【研究意义】达氏鲟(AcipenserdabryanusDumeril)，隶属于鲟形目(Acipenseriformes)，鲟科(Acipenseridae)，鲟属(AcipenserLinnaeus)，是一种较大型淡水定居性鱼类，是我国特有种，达氏鲟的肉和卵味道鲜美，富含营养，尤其是鱼卵可加工成鱼子酱[1]。由于兴修水利，过度捕捞等导致生态环境急剧变迁，达氏鲟野生种群资源日趋减少，达氏鲟的分布区逐渐缩小，于1988年被列为国家Ⅰ级保护动物。

【前人研究进展】目前，国内外对中华鲟、西伯利亚鲟、史氏鲟、俄罗斯鲟等鲟鱼类精子冷冻保存技术研究开展较多研究，已有较多报道[2-5]。达氏鲟的研究主要开展了生物学特性、人工繁育、分子生物等方面的研究[6-9]，有关抗冻剂对达氏鲟精子保存后活力和运动时间的研究未见报道。【本研究切入点】本试验通过在适宜的达氏鲟精子稀释液中配制不同浓度的抗冻剂对精子活力、运动时间和寿命的影响进行了研究。【拟解决的关键问题】旨在进一步了解达氏鲟精子的生物学特性，同时为达氏鲟精子的超低温冷冻保存研究中寻找合适的抗冻剂和保存液提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 精子采集及预处理

2014年4-5月，对本所自己培育的性成熟达氏鲟雄鱼进行人工催熟催产。用干净的干毛巾擦去体表和生殖孔周围的水及杂物，用手轻轻挤压腹部使精液自然流出，用干净干燥的塑料封口袋收集无水、无血和无粪便的精液并充氧待检，镜检精子活力，选取精子活力在95 % 以上的精液作为试验材料，将其放置于4 ℃的冰箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 稀释液的筛选 用氯化钠、氯化钾和葡萄糖分析纯试剂配制不同单因子稀释液，用不同浓度的单因子稀释液抑制精子，当某一浓度稀释液能抑制精子，再用江水激活精子时精子活力强；根据单因子试验结果调整各单因子稀释液浓度，配制氯化钠+氯化钾+葡萄糖的混合稀释液，分别为配方0.6 %氯化钠+ 0.015 %氯化钾+ 2.5 %葡萄糖，0.7 %氯化钠+ 0.02 %氯化钾+ 3.5 %葡萄糖，0.8 %氯化钠+ 0.025 %氯化钾+ 4.5 %葡萄糖的3种混合稀释液，配方编号分别为1，2和3组，直接用于江水激活的作为对照组，定位0组；用3种混合稀释液和自然江水对达氏鲟精子进行活力和寿命测定，记录精子被完全抑制后再通过用江水激活的精子寿命和活力，每组浓度重复3次，筛选出适合达氏鲟精子的稀释液。取3 尾达氏鲟亲鱼精子样本重复以上步骤，取平均值。

1.2.2 抗冻剂的配制 根据1.2.1中试验筛选得出的混合稀释液，用此稀释液分别配制4 %、8 %、12 % 、16 % 、20 % 和24 %的甲醇、乙二醇、二甲亚砜、1,3-丙二醇、丙三醇、二甲基甲酰胺不同浓度的最终抗冻剂，所用试剂均为分析纯，试剂配好后放置在4 ℃的冰箱中备用。

1.2.3 精子活力及运动时间观察 分别取4 %、8 %、12 % 、16 % 、20 % 和24 %的甲醇、乙二醇、二甲亚砜、1,3-丙二醇、丙三醇和二甲基甲酰胺抗冻剂与精液以1︰1在1.8 mL冷冻管中混合，将混合液置于4 ℃冰箱放置16 h后分别观察精子活力和运动时间。进行观察时，从冰箱中取出盛有精液混合液的冷冻管，用解剖针沾取少量的精液混合液到载玻片上，将精液混合液涂匀，放在显微镜下，用滴管取江水，滴加在精液混合液上，立即观察精子的活力和运动情况。用秒表分别记录精子的激烈运动、缓慢运动、摆尾运动的时间，每个浓度重复3次。取3 尾亲鱼精子样本重复以上步骤，取平均值。

1.2.4 精子运动阶段的划分 根据达氏鲟精子在水中的运动状态，参照四川省长江水产资源调查组[10]将鲟鱼精子的运动划分为激烈运动、缓慢运动和原地摆动3个连续的阶段。精子寿命为这3个阶段时间的总和。各阶段之间的界限，以视野中70 %以上的精子从当前运动转入后一运动，即认为精子运动时间结束，当90 %以上的精子停止颤动，即认为精子死亡。以精液与激活液接触的瞬间开始计算精子运动的时间。

1.3 数据统计分析

试验所有数据的处理和作图均采用“SPSS version 19.0”软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 稀释液对精子活力和寿命的影响

从表1可知，不同的稀释液对达氏鲟精子活力及寿命影响不同，3组稀释液中精子活力和寿命都低于对照组，2组稀释液中精子活力和寿命最高，分别为89 %和391 s，3组稀释液中精子活力和寿命最低，分别为83 %和324 s。根据试验结果最适合达氏鲟精子的稀释液为2组，配方为0.7 %氯化钠+0.02 %氯化钾+3.5 %葡萄糖。

2.2 抗冻剂对精子活力的影响

2.2.1 甲醇对精子活力的影响 从表2可看出，当甲醇浓度为4 %时，精子活力为69 %，随着甲醇浓度的增加，达氏鲟精子活力先升高后降低，当浓度为8 %时精子活力最高，为 81 %；当浓度继续增加，精子活力开始下降，当浓度增加到16 %时，精子活力降低为53 %；当浓度增加到20 %时，精子全部死亡，精子活力为0。

表1 不同稀释液对精子活力及寿命的影响Table 1 Efects of the different sperm diluents on the sperm motility and life-span

表2 不同抗冻剂对精子活力的影响Table 2 Effects of the different cryoprotectants on the sperm motility

2.2.2 乙二醇对精子活力影响 当乙二醇浓度为4 %时，精子活力为21 %，随着乙二醇浓度的增加，达氏鲟精子活力先升高后降低，当浓度为8 %时精子活力最高，为 32 %；当浓度继续增加，精子活力开始下降，当浓度增加到16 %时，精子活力降低为7 %；当浓度增加到20 %时，精子活力降低为0，精子全部死亡。

2.2.3 二甲亚砜对精子活力影响 当二甲亚砜浓度为4 %时，精子活力为52 %，随着二甲亚砜浓度的增加，达氏鲟精子活力先升高后降低，当浓度为8 %时精子活力最高，为 67 %；当浓度继续增加，精子活力开始下降，当浓度增加至24 %时，精子活力降低为11 %。

2.2.4 1,3-丙二醇对精子活力影响 当1,3-丙二醇浓度为4 %时，精子活力为52 %，随着1,3-丙二醇浓度的增加，达氏鲟精子活力先升高后降低，当浓度为12 %时精子活力最高，为 76 %；当浓度继续增加，精子活力开始下降，浓度16 %时精子活力降低为47 %，当浓度增加至20 %时，精子全部死亡。

2.2.5 丙三醇对精子活力影响 当丙三醇浓度为4 %时精子活力最高，为64 %，随着丙三醇浓度的增加，达氏鲟精子活力下降；当浓度增加到24 %时，精子活力降低为12 %。

图1 甲醇浓度对精子运动时间的影响Fig.1 Effects of MeOH concentration on the sperm movement time

2.2.6 二甲基甲酰胺对精子活力影响 当二甲基甲酰胺浓度为4 %时精子活力最高，为72 %；随着二甲基甲酰胺浓度的增加，达氏鲟精子活力下降，当浓度增加到24 %时，精子活力降低为24 %。

2.3 抗冻剂对精子运动时间的影响

2.3.1 甲醇对精子运动时间的影响 从图1可见，温度4 ℃时达氏鲟精子在不同浓度甲醇中保存16 h后用江水激活，随着甲醇浓度的增加，达氏鲟精子激烈运动、缓慢运动和原地摆动时间以及寿命均先升高后降低。当浓度为8 %时，激烈运动时间、缓慢运动时间、原地摆动时间以及寿命最长，分别为42、40、123和205 s；当浓度增加到20 %时，精子全部死亡，运动时间和寿命为0。

2.3.2 乙二醇对精子运动时间影响 从图2可见，温度4 ℃时达氏鲟精子在不同浓度乙二醇中保存16 h后用江水激活，随着乙二醇浓度的增加，达氏鲟精子激烈运动、缓慢运动和原地摆动时间以及寿命均先升高后降低。当浓度为8 %时，激烈运动时间、缓慢运动时间、原地摆动时间以及寿命最长，分别为16、29、78和123 s；当浓度增加到20 %时，精子全部死亡，运动时间和寿命为0。

图2 乙二醇浓度对精子运动时间的影响Fig.2 Effects of EG concentration on the sperm movement time

图3 二甲亚砜浓度对精子运动时间的影响Fig.3 Effects of DMSO concentration on the sperm movement time

2.3.3 二甲亚砜对精子运动时间影响 从图3可见，温度4 ℃时达氏鲟精子在不同浓度二甲亚砜中保存16 h后用江水激活，当浓度为8 %时，激烈运动时间、缓慢运动时间、原地摆动时间以及寿命最长，分别为25、23、55和103 s；达氏鲟精子激烈运动时间和寿命随着二甲亚砜浓度的增加先升高后降低，当浓度8 %时激烈运动时间和寿命最长，分别为25和103 s，当浓度增加至24 %时激烈运动时间和寿命分别降低为9和43 s。浓度8 %时精子缓慢运动时间最长，为23 s；二甲亚砜浓度4 %～12 %时缓慢运动时间先升高后降低，在浓度8 %时运动时间升高为23 s，浓度12 %时运动时间降低为18 s；浓度增加至16 %时缓慢运动时间再次升高为21 s；浓度增加至20 %时缓慢运动时间下降，浓度24 %时运动时间降低为12 s。二甲亚砜浓度4 %～16 %时原地摆动时间先升高后降低，浓度8 %时原地摆动时间最长，为55 s，浓度16 %时降低为39 s；在浓度20 %时原地摆动时间又升高为44 s，当浓度增加至24 %时原地摆动时间则降低为22 s。

图4 1,3-丙二醇浓度对精子活力的影响Fig.4 Effects of 1,3-Propanediol concentration on the sperm movement time

图5 丙三醇浓度对精子活力的影响Fig.5 Effects of Glycerol concentration on the sperm movement time

2.3.4 1,3-丙二醇对精子运动时间影响 从图4可见，温度4 ℃时达氏鲟精子在不同浓度1,3-丙二醇中保存16 h后用江水激活，精子激烈运动时间随着1,3-丙二醇浓度增加先升高后降低，当浓度为12 %时激烈运动时间最长，为36 s，浓度16 %时运动时间降低为19 s，浓度增加至20 %时精子全部死亡。1,3-丙二醇浓度4 %～12 %时缓慢运动时间先降低后升高，在浓度8 %时运动时间降低为17 s，浓度12 %时缓慢运动时间最长，为26 s，浓度继续增加后运动时间则降低，浓度16 %时运动时间再次降低为15 s，当浓度增加至20 %时精子全部死亡。精子原地摆动时间随着1,3-丙二醇浓度增加而降低，当浓度4 %时原地摆动时间最长，为76 s；当浓度增加至16 %时运动时间降低为30 s，浓度继续增加至20 %时精子全部死亡。浓度12 %时精子寿命最长，为127 s；1,3-丙二醇浓度4 %～12 %时精子寿命先降低后升高，在浓度8 %时寿命降低为109 s，浓度12 %时寿命时间升高为127 s，浓度16 %时寿命再次降低为64 s，当浓度继续增加至20 %时精子全部死亡。

2.3.5 丙三醇对精子运动时间影响 从图5可见，温度4 ℃时达氏鲟精子在不同浓度丙三醇中保存16 h后用江水激活，精子激烈运动时间随着丙三醇浓度增加先降低后升高再降低，当浓度4 %时运动时间最长，为25 s，在浓度8 %时运动时间降低为14 s，但是在浓度12 %时运动时间又升高为17 s，浓度增加到16 %时继续增加浓度运动时间则降低，浓度24 %时运动时间降低为3 s。浓度8 %和16 %时精子缓慢运动时间最长，为21 s，浓度4 %～16 %时精子缓慢运动时间随着浓度增加先升高后降低再升高，浓度8 %时运动时间升高为21 s，浓度12 %时运动时间则降低为18 s，浓度增加至16 %时时间又升高为21 s，当浓度增加至20 %时，继续增加浓度运动时间降低，浓度24 %时运动时间降低为8 s。原地摆动时间和寿命随着丙三醇浓度增加而降低，浓度4 %时原地摆动时间和寿命最长，分别为54 和96 s，当浓度增加至24 %时原地摆动时间和寿命最短，分别为20 和31 s。

图6 二甲基甲酰胺浓度对精子运动时间的影响Fig.6 Effects of N,N-Dimethylformamide concentration on the sperm movement time

2.3.6 二甲基甲酰胺对精子运动时间影响 从图6可见，温度4 ℃时达氏鲟精子在不同浓度二甲基甲酰胺中保存16 h后用江水激活，精子激烈运动时间和寿命随着二甲基甲酰胺浓度增加而降低，当浓度4 %时运动时间和寿命最长，分别为27 和132 s，当浓度增加至24 %时运动时间和寿命分别降低为9和70 s。缓慢运动时间随着二甲基甲酰胺浓度增加先升高后降低，浓度为12 %时缓慢运动时间最长，为45 s，继续增加浓度运动时间则降低，当浓度24 %时运动时间降为13 s。原地摆动时间随着二甲基甲酰胺浓度增加总体是降低，当浓度4 %时原地摆动时间最长，为71 s，浓度为8 %～16 %时原地摆动时间分别为61、58和62 s，原地摆动时间比较接近，当浓度增加至20 %时原地摆动时间降低为52 s，浓度24 %时摆动时间降低为48 s。

3 讨 论

3.1 稀释液对精子活力及运动时间影响

鱼类精子在精巢和精浆中受到抑制不活动,若抑制条件被解除则会被激活激烈运动起来,激烈运动的精子如果处于抑制环境,其活动又受到抑制,抑制条件被解除后将再次被重新激活,可以如此反复。添加稀释液可以保持精细胞的活力,延长其保存时间[11]，不同鱼类精子运动的诱导机制不尽相同，淡水鱼类精子的激活是由淡水环境的低渗所诱发，而海水鱼类精子运动则是由海水的高渗所刺激[12]。本试验中适量的Na+和K+能够抑制达氏鲟精子并能被激活的结果，与Morisawa等研究的用不同渗透压的NaCl、KCl和甘露醇溶液作精子激活试验,发现一些淡水硬骨鱼类,如鲫、褐三齿雅罗鱼的精子在高渗透压溶液中,精子不活动,呈抑制状态,若加1滴去离子水,精子立刻被激活而运动,而用低渗透压溶液去稀释精子,同样能诱发精子从抑制到激活状态[13]；与江世贵等通过对中华乌塘鳢精子激活的研究中认为K+的存在能对中华乌塘鳢精子的活动有抑制作用[14]；与刘鹏等研究结果显示K+为2.7 mM时西伯利亚鲟精子活力被完全抑制[2]；与赵亚龙等的研究的大口胭脂鱼精子在NaCl浓度达1.0 %时,精子出现不活动状态,但滴加1滴去离子水后,精子可被激活,出现运动现象的研究成果[15]，基本一致。

3.2 抗冻剂对精子活力及运动时间的影响

几种抗冻剂相比，在8 %的甲醇中达氏鲟精子的激烈运动时间和寿命最长，可长达42和205 s，远远高于其它几种抗冻剂中达氏鲟精子的激烈运动时间和寿命。甲醇、乙二醇和1,3-丙二醇浓度增加至20 %时，达氏鲟精子的寿命急剧缩短，全部死亡无运动，但丙三醇、二甲基甲酰胺和二甲亚砜抗冻剂浓度增加至24 %时，达氏鲟精子激活后仍有一定活力和寿命。试验表明不同抗冻剂的不同浓度对达氏鲟精子的活力和运动时间影响各不相同，达氏鲟精子对高浓度甲醇、乙二醇和1,3-丙二醇的耐受力较差，高浓度时对精子毒性较大，致死时间短，达氏鲟精子对丙三醇、二甲基甲酰胺和二甲亚砜的耐受性较强。

试验中不加入稀释液和抗冻剂的对照组精子即使在4 ℃条件下保存16 h，直接用自然江水激活后，精子活力和寿命较高，分别为89 %和317 s,表明达氏鲟精子没有外界条件干预时精子活力和寿命均较高；加入不同浓度的抗冻剂4 ℃条件保存16 h后，即使用自然江水激活，精子活力和寿命不同程度地降低，在高浓度时甚至全部死亡，说明不同抗冻剂不同浓度对达氏鲟精子具有不同程度的毒性作用。这试验结果，与荆荣燕研究的抗冻剂的浓度越大，毒性就越强，精子活力就越低的结论[16]；与章龙珍等研究结果，二甲亚砜对鱼类精子的抗冻保护效果最好,但不同鱼类的最适浓度不尽相同，对精子具有不同毒性[17]；与闫秀明等研究结果，10 %二甲亚砜对黄鳝精子的抗冻保护作用最好，毒性作用最弱[18]；与刘本伟等研究结果,甲醇对鱼类精子伤害较大,毒性较强[19]；与苏新有研究结果，甘油对玛丽鱼的精子毒性影响较低，但其仍然可以在短时间内造成精子的大量死亡的研究结果[20]基本相似。

3.3 达氏鲟精子超低温保存液

本试验通过用0.7 %氯化钠+0.02 %氯化钾+3.5 %葡萄糖的混合稀释液配制6种抗冻剂形成不同浓度的保存液，筛选适合达氏鲟精子保存的抗冻剂，以便配制超低温保存液。根据相关文献报道:Glogowski.J，JAHN Ichen.H和Harvey .B研究表明甲醇相对二甲亚砜和甘油来说是低毒的,而且对许多细胞的保存效果比二甲亚砜和甘油好[21-23]。Lahnsterner.F等研究表明在许多淡水及洄游性鱼类精子保存中,甲醇比二甲亚砜更适合作为超低温冷冻的抗冻剂[24-25]。章龙珍等研究结果，俄罗斯鲟精子在10 %甲醇作为抗冻剂的保存液超低温保存后，精子中SOD、CAT、GSH-PX活性较鲜精组显著降低，较未添加保护液组显著升高，GR活性则显著高于鲜精组，但显著低于未添加保护液组[3]。刘鹏等研究结果,西伯利亚鲟精子冷冻保存抗冻剂甲醇最佳浓度为18 %，精子活力达到(51.8±5.8) %[2]。苏德斌等研究结果，8 %甲醇作为史氏鲟精子抗冻剂，二步法超低温(-196 ℃)冷冻保存5 h后取出，解冻后激活率为(52.3±3.5) %[4]。历萍研究结果，中华鲟精子在20 mM(Tris)，75 mM(Suerose)，0.5 mM(KCl)，pH 8.5的稀释液中抗冻剂甲醇8 %时，彗尾DNA百分率均最小，而且C级和D级损伤的细胞相对较少(不超过30 %)，而且彗尾DNA百分率与解冻后精子的运动速率呈显著负相关(Irl>0.8，P<0.05)[5]。本研究中采用的0.7 %氯化钠+0.02 %氯化钾+3.5 %葡萄糖的稀释液与上述报道的精子稀释液不同，但冷冻前达氏鲟精子在甲醇浓度8 %、1,3-丙二醇浓度12 %和二甲基甲酰胺浓度4 %中可以较长时间激烈运动且寿命相对较长，在甲醇浓度8 %时精子活力、激烈运动时间和寿命最好。用一定浓度的这几种抗冻剂进行超低温(-196 ℃)冷冻保存后，达氏鲟精子是否可以获得较好的活力，较长激烈运动时间和寿命，这还有待于以后更进一步的开展研究。

3.4 超低温冷冻保存原理及意义

精液的成分大部分是水，精液超低温保存的关键主要取决于水的性质。温度低于精液冰点时水开始结冰，冰点至-60 ℃是形成有序状态冰晶的温度区。细胞内冰晶的形成会机械损伤细胞结构；细胞外结冰会导致细胞失水，使细胞变形、破裂死亡。当温度低于-60 ℃时，有序状态的冰晶减少；当温度低于-130 ℃时，水分子停止运动，保持原来的无序状态，形成坚硬、均质的四块结构，这种现象叫玻璃化[26]。玻璃化状态的精子不会出现原生质严重脱水的现象而使细胞保持完整结构，精子解冻后即可恢复运动能力。抗冻剂在鱼类精子的超低温冷冻保存中必须加入，适当抗冻剂的加入，可以有效减少精子冷冻过程中的冷冻损伤，有效地保护精子，达到长期冷冻保存的目的。抗冻剂在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化水的结晶作用，减少冰晶的形成，达到保护冻存精子的目的[12]。常用的防冻剂主要包括两大类:渗透性防冻剂和非渗透性防冻剂。渗透性防冻剂是一类含有-OH 基的小分子化合物，如丙三醇、二甲亚砜、乙二醇、1,3-丙二醇等，它们可以自由通过细胞膜;非渗透性防冻剂是一类不能透过细胞膜的大分子物质，如卵黄、糖类、脂蛋白等，主要增加细胞膜结构的稳定性和缓解冷冻损伤。不同物种精子的抗冻剂选择应根据预试验、或逐个试验筛选其对该物种精子冷冻保护效果[27]。

精子在超低温(-196 ℃)条件下，其运动和代谢活动完全停止，精子处于假死状态，但其结构完整，生命以静止状态保存下来。达氏鲟精液超低温保存将在达氏鲟人工繁殖中雌雄亲鱼成熟不同步、扩大苗种生产，避免近亲交配，建立达氏鲟冷冻精子库，稳定遗传性状和种质资源保等方面有着重要意义。低温冷冻技术不仅能够保护达氏鲟这一珍稀物种、提高其繁殖潜力和进行异地或异时受精成为可能以外，还能为达氏鲟种质资源保护和生物多样性的保护开辟了新途径，为达氏鲟的遗传育种和现代生物技术的研究长期不间断的提供生物材料等方面也具有重要的意义。

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EffectsofSomeDifferentCryoprotectantsonSpermMotilityandMovementTimeofAcipenserdabryanus

HE Bin1,2,CHEN Yan-ling1,LONG Zhi-hai1,YAN Jun-gang1,ZHAO Feng-qi1,XIA Mei3,CHEN Xian-jun1*

(1.Fisheries Institute Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Sichuan Yibin 644000,China; 2.Sichuan Provincial Laboratory for Biotic Resource Protection and Sustainable Utilization,Sichuan Chengdu 610041,China; 3.Shiqian County of Guizhou Animal Husbandry Centre of Development,Guizhou Shiqian 555100,China.)

【Objective】The present paper was to study the effects of different concentrations of cryoprotectants on the sperm motility,life-span and movement time ofAcipenserdabryanus.【Method】Six kinds cryoprotectants of 4 %Methanol,8 %Ethyleneglycol,12 %Propanediol,6 %Glycerol,20 %N,N-Dimethylformamide and 24 %Dimethyl sulfoxide were respectively conducted with sperm diluents (0.7 % NaCl+0.02 % KCl+3.5 % Glu),and the sperm by cryoprotectants was preserved 16 hours at 4 ℃ and activated.【Result】The sperm ofAcipenserdabryanushad sperm motility and life-span with 4 %-24 % cryoprotectant(Glycerol,N,N-Dimethylformamide and Dimethyl Sulfoxide) and 4 %-16 % cryoprotectant(Methanol,Ethyleneglycol and Propanediol),but the all sperm was died with 20 %-24 % cryoprotectant(Methanol,Ethyleneglycol and Propanediol).The sperm motility was 82 %,32 %,76 %,64 %,72 % and 67 %,respectively when 8 % Methanol,8 % Ethyleneglycol,12 % Propanediol,4 % Glycerol,4 % N,N-Dimethylformamide and 8 % Dimethyl sulfoxide were applied,The drastic movement time and life-span of the sperm were the longest and respectively achieved 42 and 205 s,16 and 123 s,36 and 127 s,25 and 96 s,27 and 132 s,25 and 103 s.As compared with other cryoprotectants,the drastic movement time and life-span of the sperm were the longest and respectively achieved 42 and 205 s with 8 % Methanol.【Conclusion】Six kinds of cryoprotectants could produce toxicity on the sperm,and the motility and life-span of the sperm could be reduced after preserved by these cryoprotectants.

Acipenserdabryanus; Cryoprotectant; Sperm motility; Movement time

1001-4829(2017)4-0962-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.040

2015-07-15

四川省财政基因工程青年基金项目(2013QNJJ-015)

何 斌 (1978-)，男，四川宜宾人，助理研究员，主要研究方向为水产健康增养殖及鱼类资源生态，E-mail: shuichans123@126.com，*为通讯作者：陈先均，主要研究方向为水产动物人工繁育，E-mail: chen-xianjun@163.com。

S965.215

A

(责任编辑 陈 虹)