禾花鲤致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定、耐药性及毒力基因检测

邓小红，梁静真，黎姗梅，吕小丽，韦慕兰，韩书煜，蒙兰丽，黄 钧*，蒋经运

(1.广西水生动物病害诊断实验室，广西 南宁 530005；2.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004；3.广西水产技术推广总站，广西 南宁 530022；4.陆川县水产养殖技术推广站，广西 陆川 537700；5.全州县水产技术推广站，广西 全州 541500；6.都安瑶族自治县水产技术推广站，广西 都安 530700；7.田东县水产技术推广站，广西 田东 531500)

禾花鲤致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定、耐药性及毒力基因检测

邓小红1，5，梁静真1，2，黎姗梅3，吕小丽4，韦慕兰6，韩书煜3，蒙兰丽7，黄 钧1，2*，蒋经运5

(1.广西水生动物病害诊断实验室，广西 南宁 530005；2.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004；3.广西水产技术推广总站，广西 南宁 530022；4.陆川县水产养殖技术推广站，广西 陆川 537700；5.全州县水产技术推广站，广西 全州 541500；6.都安瑶族自治县水产技术推广站，广西 都安 530700；7.田东县水产技术推广站，广西 田东 531500)

【目的】对广西全州县飞机坪鱼种场患病禾花鲤进行病原菌的分离鉴定，并对其致病性、耐药特性及6种毒力基因进行检测，为细菌引起的禾花鲤疾病及防控技术研究提供理论参考。【方法】从患病禾花鲤的肝脏、心脏和肾脏等部位取样分离细菌，人工感染确定菌株的致病性，API生化鉴定和16S rRNA分子鉴定相结合进行细菌鉴定，细菌的耐药特性试验为K-B纸片扩散法，毒力基因以PCR扩增法检测。【结果】从患病禾花鲤中分离到2株致病力很强的病原菌株TH1和TH3，对健康禾花鲤的致死率均为100.00 %；经生化和分子鉴定，2株分离菌株均为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，与标准菌株AeromonashydrophilaATCC 7966(NR 118944)的亲缘关系最近，同源相似度99.80 %；2株菌株对硫酸新霉素等5种药物高度敏感，对青霉素G等4种药物不敏感；TH1携带所检测的hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp6种毒力基因，TH3只携带hly、Aer、Alt、Act、ahal5种基因。【结论】引起广西全州县飞机坪鱼种场禾花鲤大批死亡的病原菌是嗜水气单胞菌，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分别为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，对健康禾花鲤的致死率均为100.00 %，对硫酸新霉素等5种药物高度敏感，对青霉素G等4种药物不敏感。

禾花鲤；嗜水气单胞菌；耐药性；毒力基因

【研究意义】原产于广西桂北地区的禾花鲤(Procyprismerus)是鲤(Cyprinuscarpio)的变种，体型短肥，个体重多在250 g以下，属小型经济鱼类。禾花鲤因含肉率高、肌肉中富含人体所需的必需氨基酸，营养价值高[1]而深受消费者的喜爱，被列入广西桂林市农产品的十大名牌行列，广西全州县也将其作为特种水产养殖品种大力发展。禾花鲤的稻田养殖在广西桂北地区具有悠久历史，养殖区域主要集中在兴安、全州、灌阳、三江和融安等县[2]，近年来，禾花鲤的稻田养殖规模不断扩大，在养殖过程中的病害问题也越来越常见，尤其是细菌性疾病造成的损失有逐年增加的趋势，在广西全州县各养殖场的禾花鲤经常出现暴发性死亡现象，造成损失严重，对当地禾花鲤养殖业已构成严重威胁，因此，研究患病禾花鲤的病原菌及其药敏特性显得尤为迫切和重要。【前人研究进展】有关鲤的细菌性疾病已有不少报道，主要有鲤鱼的出血病、细菌性败血症、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)病、鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)病、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)病和杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)病[3-10]，锦鲤的吉氏库特菌(Kurthiagibsonii)病、溃疡病和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)病[11-13]，有色鲤鱼的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)[14]等。在禾花鲤中，由细菌引起的疾病目前仅见龙苏等[15-16]报道的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)病和暴发性死亡征，而有关禾花鲤致病性嗜水气单胞菌分离鉴定以及禾花鲤病原菌毒力基因型的研究报道鲜见。【本研究切入点】对引起广西全州县飞机坪鱼种场禾花鲤大批死亡的病原菌嗜水气单胞菌进行分离鉴定，研究患病禾花鲤的病原菌及其药敏特性。【拟解决的关键问题】本试验对广西全州县飞机坪鱼种场患病禾花鲤进行了病原菌的分离鉴定，并对病原菌的致病性、耐药特性以及hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp6种毒力基因进行检测，以期为嗜水气单胞菌引起的禾花鲤疾病及防控技术研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

禾花鲤病样采自广西全州县飞机坪鱼种场，个体重30.6～38.3 g。健康禾花鲤购自广西大学农贸市场，体长约10 cm，个体重35 g左右，肉眼未见病症，购回后先经15 d的检疫暂养，在人工感染试验前，随机抽取5尾按常规进行病检，并取每尾鱼的心、肝、脾、肾、脑等组织进行细菌的分离接种，确认试验鱼健康。

API全自动细菌鉴定仪及相关试剂为法国梅里埃公司生产，培养基和细菌基因组 DNA提取试剂盒分别购自郑州安图生物工程股份有限公司和天根生化科技(北京)有限公司，TaqDNA 酶等PCR扩增试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，琼脂糖购自Invitrogen(美国)公司，PCR扩增的细菌通用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 病鱼的剖检及细菌分离

在实验室中对病鱼进行常规剖检，先后对体表、鳃和内脏器官的病症进行肉眼观察，对体表粘液、鳃组织和肠道内膜取样镜检，进行寄生虫检查。

从病鱼的心脏、肝脏等组织取样进行细菌分离接种，37 ℃培养18～24 h，挑取优势菌落纯化后置4 ℃保存备用。

1.3 无菌滤液的人工感染

无菌滤液是参照黄艳华等[17]和黄钧等[18]的方法，取病鱼的内脏器官匀浆，10 ℃条件下高速离心0.5 h后取上清液，经微孔细菌滤器过滤后获得，并以平板涂布培养法检测其无菌性。将健康禾花鲤随机分成30尾/组的试验和对照2组，通过胸鳍基部腹腔注射分别注射无菌滤液和无菌生理盐水(0.2 mL/尾)，注射后连续饲养观察18 d。期间正常饲养管理，连续充气增氧，每天上午和下午各1次对受试鱼的发病及死亡等情况进行记录。

1.4 分离菌株的人工感染

以无菌生理盐水将经过3次复壮培养的备用菌株新鲜培养物制成菌悬液，菌悬液的细菌浓度以WGZ-2-XJ细菌浊度仪进行调整。按无菌滤液的人工感染方法进行第1次人工感染试验，从第1次人工感染试验中取发病症状与自然发病症状相似的濒死个体分离细菌后，按同样的方法再进行第2次人工感染试验。试验期间的日平均水温为(25.5±1.3) ℃。

1.5 菌株的鉴定

1.5.1 菌株基本形态及溶血性观察 革兰氏染色观察菌株的形态和染色特性，将分离菌株接种于兔血培养基上37 ℃培养24 h后观察其溶血性。

1.5.2 生化鉴定 以API全自动细菌鉴定仪进行生化鉴定。

1.5.3 分子鉴定 按黄艳华等[17]和黄钧等[18]的方法，将分离菌株在28 ℃震荡(200 r/min)培养16 h后，配成浓度约0.5 MCF的菌悬液，经离心收集菌体，细菌DNA提取后-20 ℃保存备用。细菌16S rRNA基因PCR扩增引物为fD1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，rp2：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系(25 μl)及扩增条件除DNA模板调为2 μl和退火温度调为58 ℃外，其余均按黄钧等[18]的方法进行。PCR反应结束后以1.5 %琼脂糖凝胶电泳法(100 V电压下电泳35 min)进行鉴定，凝胶成像分析系统观察，根据电泳条带确定和记录结果，PCR产物送华大生物技术有限公司进行测序。多重序列比对分析以CLUSTAL X软件完成，系统发育树以MEGA6.1软件构建。

1.6 菌株的耐药性试验

K-B纸片扩散法，药敏纸片从杭州天和微生物试剂有限公司购得，试验及结果判定按黄钧等[18]的方法进行。

1.7 菌株的毒力基因型检测

先按黄艳华等[17]、黄钧等[18]的方法提取细菌基因组DNA后于-20 ℃保存备用。各选1对特异性引物对菌株的毒力基因hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp进行PCR扩增，扩增引物序列、退火温度、基因片段大小、目的基因的鉴定等均按黄艳华等[17]和黄钧等[18]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 病鱼的主要症状及细菌分离结果

肉眼观察到的自然发病禾花鲤主要症状为：体表发红有大量粘液、无肉眼可见寄生虫，腹部肿大，肛门发红，鳃肿胀，鳃丝末端溶解，体腔中有大量腹水，胆囊肿大，脾脏肿大。对体表粘液、鳃组织和肠道内膜的镜检结果均未发现寄生虫。从两口发病池塘患病禾花鲤肝脏组织中共分离到2株β-溶血的优势菌株TH1和TH3，均为革兰氏阴性短杆菌，2株菌株在普通营养琼脂培养基上的菌落形态为圆形，边缘完整光滑，中央微隆起，白色或淡黄色，半透明，直径1.25～2.06 mm。

2.2 人工感染试验结果

涂布于普通营养琼脂培养基上的无菌滤液经37 ℃培养24 h无菌落，将无菌滤液人工感染禾花鲤18 d后，试验组、对照组的禾花鲤均无病症出现，也无死亡现象。据此认为广西全州县飞机坪鱼种场禾花鲤发病死亡由病毒引起的可能性不大。

2次菌悬液人工感染结果，TH1和TH3对禾花鲤均有很强的致病力，试验组在注射菌悬液后8～24 h出现死亡，3～5 d为死亡高峰期，6～7 d全部死亡(表1)，试验结束时对照组的成活率为100.00 %，且活动和摄食均正常，无肉眼可见的病症。注射菌悬液后开始出现死亡的试验鱼发病症状不明显，2 d后发病死亡的个体均出现鳃肿胀，鳃丝末端溶解，体表发红粘液多，腹部膨大，肛门发红，体腔中有大量腹水，胆囊和脾脏肿大等与自然发病鱼很相似的症状。表明TH1和TH3菌株都是引起广西全州县飞机坪鱼种场禾花鲤发病死亡的病原菌。

2.3 API生化鉴定结果

TH1、TH3均为氧化酶试验阳性，在API生化试验中，2株病原菌的硝酸钾、色氨精、葡萄糖、精氨酸、七叶灵、明胶、对硝基-β-D甲基半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、癸酸、苹果酸、柠檬酸和四甲基-对一苯二胺试验呈阳性，脲素和苯乙酸试验呈阴性；已二酸试验TH1呈阴性，TH2呈阳性。API鉴定结果，2株病原菌均为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)。

表1 分离菌株的人工感染结果Table 1 Results of artificial infection of isolated strains

表2 病原菌株的药敏试验结果(抑菌圈直径，mm)Table 2 Antibiotic sensitivity test results of the tested strains (Diameter of inhibition zone，mm)

2.4 分子鉴定结果

16S rRNA基因片段的PCR扩增和PCR产物的测序结果，病原菌TH1和TH3的16S rRNA基因序列长度均为1373 bp(图1)，GenBank登录号分别为KU143917和KT961634。将菌株的序列与Genbank中已有序列进行BLAST比对结果，TH1和TH3与嗜水气单胞菌标准株AeromonashydrophilaATCC 7966(NR 118944)的亲缘关系最近，同源相似度均为99.80 %。构建的系统发育树见图2。

2.5 菌株的耐药特性

对2株病原菌都高度敏感的药物有多粘菌素B、左氧氟沙星、头孢他啶钠、依诺沙星和硫酸新霉素5种，都不敏感的药物有青霉素G、氨苄青霉素、氟苯尼考和磺胺对甲氧嘧啶4种。对其他药物的敏感性在2株病原菌株之间存在较大差异(表2)。

2.6 毒力基因检测结果

PCR扩增结果表明，病原菌TH1和TH3扩增到的毒力基因片段均与预期片段大小相符，检测结果，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分别为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-。

图1 TH1和TH3的16S rRNA 基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of 16S rRNA genes of strain TH1 and TH3

3 讨 论

引起广西全州县飞机坪鱼种场大批禾花鲤发病死亡的病原菌是嗜水气单胞菌(A.hydrophila)，与众多学者对鲤的细菌性疾病研究结果[5-9,11-14]不同，与龙苏等[15-16]从患病禾花鲤中分离到病原菌也不一致。综合前人和本试验的研究结果可以看出，禾花鲤等多种鲤鱼细菌性疾病的病原菌种类表现为多样性，均可造成严重危害，尤其是嗜水气单胞菌，是鲤鱼养殖过程中危害特别严重的常见病原菌，一些如鳗利斯顿氏菌、肺炎克雷伯氏菌、吉氏库特菌、荧光假单胞菌、简达气单胞菌和铜绿假单胞菌等是近年来在多种鲤鱼中新发现的病原菌，应引起广大鱼病工作者和养殖人员的共同关注。

本试验从患病禾花鲤中分离到的2株嗜水气单胞菌TH1和TH3对禾花鲤的致死率均为100.00 %，与该菌对其他水生动物人工感染试验的致死率结果[19-21,22-24]一致。另外，本试验中，2株菌株虽然都是嗜水气单胞菌，但在API鉴定中发现两者的生化特性稍有不同，这一差异主要与2株菌株对已二酸的分解结果不同有关。

在本研究的药敏试验结果中，2株病原菌TH1、TH3对药物的敏感性存在较大差异。都高度敏感的药物只有5种，都不敏感的药物有4种，对其他药物的敏感性2株菌株之间存在较大差异(表2)。已知嗜水气单胞菌因毒力基因型不同，其致病力也不同[23]，2株病原菌株TH1和TH3对药物敏感性存在差异，是否与菌株所携带的耐药基因不同有关，有待进行更深入的研究。很多情况下，防治由嗜水气单胞菌等细菌引起的水生动物疾病常以含氯消毒剂作为外用药[20]。

图2 TH1和TH3的16S rRNA 基因序列系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain TH1 and TH3

据已有的检测结果，黄沙鳖源嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的基因型分别有10和6种，均以hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+为主，分别占检测菌株数的55.74 %和50.00 %[23-24]；胡子鲶源气单胞菌的毒力基因型也各有不同，其中，嗜水气单胞菌的毒力基因型为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+2种，而温和气单胞菌为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-和hly-Aer+Alt-Act+ahal-ahp-2种[25]。本试验中，TH1的毒力基因型为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+，与黄沙鳖源嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的主要毒力基因型一致，这一基因型在胡子鲶源嗜水气单胞菌中也检测到，但在胡子鲶源温和气单胞菌中未检测到[27]，可能与检测样本量有关；TH3的基因型为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，这一基因型在胡子鲶源嗜水气单胞菌和温和气单胞菌中均检测到[27]，但在黄沙鳖源嗜水气单胞菌(61株)和温和气单胞菌(14株)中均未检测到[17-18，23-24]，这种差异是否与菌株的动物源性不同有关，尚须更多的深入研究结果予以证明。TH1和TH3携带所检6种毒力基因中包含hly和Act在内的5到6种，对禾花鲤的致死率均为100.00 %，均属强毒株，此结果与刘杰等[23]的研究结果一致。

4 结 论

引起广西全州县飞机坪鱼种场禾花鲤大批死亡的病原菌是嗜水气单胞菌，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分别为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，对健康禾花鲤的致死率均为100.00 %，对硫酸新霉素等5种药物高度敏感，对青霉素G等4种药物不敏感。

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Isolation,Identification,AntibioticResistanceandVirulenceGenesDetectionofPathogenicAeromonashydrophilainCyprinuscarpio

DENG Xiao-hong1，5，LIANG Jing-zhen1，2，LI Shan-mei3，LV Xiao-li4，WEI Mu-lan6，HAN Shu-yu3，MENG Lan-li7，HUANG Jun1，2*，JIANG Jing-yun5

(1.Guangxi Aquatic Animal Diseases Diagnosis Laboratory,Guangxi Nanning 530005,China; 2.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Guangxi Nanning 530004,China; 3.Guangxi General Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Nanning 530022,China; 4.Luchuan Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Luchuan 537700,China; 5.Quanzhou Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Quanzhou 541500,China; 6.Du’an Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Du’an 530700,China; 7.Tiandong Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Tiandong 531500,China)

【Objective】In order to providea reference for effective prevention and control of bacterial disease ofProcyprismerus,the study was conducted to isolate and identify the pathogen of bacterial disease inProcyprismerus in the Feijiping fingerling farm in Quanzhou Guangxi,the pathogenicity,antibiotic resistance and six kinds of virulence genes of the pathogen were tested.【Method】The pathogen was isolated from parts such as the liver,heart and spleen tissues in the diseasedProcyprismerus in this study.An artificial infection was measured on the pathogenicity of the isolated strains.Bacterial identification was finished by API biochemical analysis combined with 16S rRNA gene sequencing.The K-B paper diffusion method was used to test antibiotic resistance of the pathogen,presence of virulence genes was determined by using the PCR method.【Result】Two virulent pathogenic strains TH1 and TH3 were isolated from diseasedProcyprismerus.The two strains both contributed a fatality rate of 100.00 % to healthyProcyprismerus carps.Moreover,the strains were both identified asAeromonashydrophila,and had the closest genetic relationship relatives with the standard strain ATCC 7966 (NR 118944) ofA.hydrophila,sharing homology of 99.80 %.The two strains were highly sensitive to five kinds of antibiotics including neomycin sulphate,however,they were insensitive to four kinds of antibiotics including penicillin G.Strain TH1 carried six kinds of virulence genes includinghly,Aer,Alt,Act,ahalandahp.Whereas strain TH3 carried five virulence genes includinghly,Aer,Alt,Act,ahal.【Conclusion】The pathogens causing fulminant death ofProcyprismerus wereA.hydrophilain the Feijiping fingerling farm in Quanzhou,Guangxi.The genotypes of the pathogenic strain TH1 and TH3 werehly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+andhly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-,respectively,and the pathogens contributed a fatality rate of 100.00 % to healthyProcyprismerus.The pathogens were highly sensitive to five kinds of antibiotics including neomycin sulphate,however,they were insensitive to four kinds of antibiotics including penicillin G.

Procyprismerus;Aeromonashydrophila; Antibiotic resistance; Virulence genes

1001-4829(2017)4-0952-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.038

2016-12-10

广西水产畜牧兽医局专项项目(桂渔牧财[2013]35号，桂渔牧财[2014] 52号，桂渔牧财[2015] 97号)

邓小红(1976-)，女，广西全州人，工程师，从事水产养殖及病害防控技术的研究和推广，E-mail：574875004 @qq.com，*为通讯作者，E-mail：hj1351@163.com。

S965.116

A

(责任编辑 王冠玉)