对节白蜡树叶提取物杀菌活性初步研究

吴清来，张良菊，徐慧慧，徐志红，李俊凯

(长江大学农学院 长江大学农药研究所，湖北 荆州 434025)

对节白蜡树叶提取物杀菌活性初步研究

吴清来，张良菊，徐慧慧，徐志红，李俊凯*

(长江大学农学院 长江大学农药研究所，湖北 荆州 434025)

【目的】研究对节白蜡的抗病原因，探寻新的生物农药。【方法】对对节白蜡树叶中的化合物质进行了分离提取，并将提取物分别对小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、棉花红腐病菌、核桃根腐病菌、马铃薯早疫病菌、苹果斑点落叶病菌进行室内生物活性测定试验，为了进一步锁定有效成分，对乙酸乙酯萃取物进行了柱层析初步分离，并进行了组分杀菌活性测定。【结果】在500 μg/mL浓度下，乙酸乙酯萃取物整体表现出较好活性，其中对苹果斑点落叶病和棉花红腐病的抑制率分别达到78.0 %、69.0 %。组分1和组分4整体表现出优于其他组分的杀菌活性，其中组分1对棉花红腐病、苹果斑点落叶病的抑制率分别达到70.0 %和79.0 %，组分4苹果斑点落叶病的抑制率也达到74.0 %。【结论】对节白蜡提取物对部分病菌具有一定的抑制效果，为研究对节白蜡的抗病原因打下了一定的基础。

对节白蜡；提取物；杀菌活性；生物农药

【研究意义】对节白蜡鲜有病虫害，很有可能自身能够产生抗虫、抗病的活性物质，帮助其免于病虫害的影响，而目前有关对节白蜡抗虫抗病方面的研究尚属空白。【前人研究进展】对节白蜡(Fraxinushupehensis)是湖北农学院苏丕林教授于1975年首次发现的白蜡属新种[1-2]，初发现时仅分布于湖北省钟祥京山大洪山南麓山丘地带，因此又名湖北梣、湖北白蜡、对节树、望乡树[1,3]。对节白蜡是我国二级珍稀保护植物[4-5]，具有很好的应用价值[6]：树皮作为中药秦皮的来源之一，具有重要的药用价值[7-8]；对节白蜡是世界仅存的木犀白蜡名贵树种，是世界景点、盆景、根雕家族的极品[9]；对节白蜡盆景被誉为“活化石”或“盆景之王”[9]。

【本研究切入点】对节白蜡鲜有虫害，蚜虫、螨虫、线虫、红蜘蛛等均不会对其造成影响。仅是刚出嫩芽时，芽梢会偶受病虫影响，数天后芽叶老化，危害会自动消除。白粉病、立枯病等均不对其造成危害[10]。【拟解决的关键问题】为了明确对节白蜡的抗病原因，针对对节白蜡树叶提取物进行了室内杀菌活性实验，以期发现或开发出一种新型防治病害的生物农药。

1 材料与方法

1.1 供试材料

对节白蜡树叶于2016年3月采自长江大学农学院园艺盆景园，室温阴干备用。

试剂：对节白蜡树叶提取物所用的溶剂为工业用无水甲醇，提取物分离纯化和不同浓度提取物配制所用的石油醚、氯仿、乙酸乙酯均为市售的化学纯试剂，水为哇哈哈纯净水。

1.2 供试病原菌

小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)；棉花红腐病菌(Fusariumrotofcotton)，核桃根腐病菌(Walnutrootrot)，马铃薯早疫病菌(Potatoearlyblight)，苹果斑点落叶病菌(Alternariaalternataf.sp.mali)。以上菌种由长江大学农学院植物保护教研组提供。

1.3 试验方法

1.3.1 提取物的制备[11-12]在室温下，将阴干的对节白蜡树叶(1000.0 g)依次用1500 mL无水甲醇冷浸提取3 、2、1 d，充分将对节白蜡树叶中的提取物提取出来，提取液减压浓缩至无溶剂蒸出，得甲醇浸提物。甲醇浸提物先用蒸馏水溶解，然后采用“液-液萃取法”，先用石油醚萃取3次，再用氯仿萃取3次，最后用乙酸乙酯萃取3次，分别用旋转蒸发仪减压浓缩至无溶剂蒸出，然后置于通风橱内氮气吹干备用。水层浓缩后，用无水乙醇溶解浓缩带水3次，然后置于通风橱内氮气吹干备用，结果见表1。

1.3.2 药液的配置 将对节白蜡树叶不同溶剂提取得到的供试样品用无水乙醇溶解，再用含0.1 %吐温80的水稀释至500 μg/mL，其中无水乙醇含量为5 %，用其进行杀菌活性测定。

1.3.3 对供试病菌的室内活性测定 采用离体平皿法[13]，以供试病原菌为对象，对所合成的化合物进行杀菌活性测定。药液以乙醇为溶剂，实验终浓度为500 μg/mL。将配制好的药液各取1 mL于已灭菌的培养皿中，再取冷却到45 ℃左右的PDA培养基9 mL倒入培养皿，充分混匀，置平板使凝固。然后用打孔器移接菌饼，菌面向下接于含毒培养基中心，每皿1块，放于恒温箱中，培养2 d后测量菌落直径，通过以下公式计算抑制率。

抑制率 % =(对照菌落直径-处理菌落直径)÷ 对照菌落直径 × 100 %

每个样品重复3次，以加入无菌水的培养基为对照。

2 结果与分析

2.1 对节白蜡树叶甲醇浸提物在不同极性溶剂中的分配率

采用上述提取方法，得到对节白蜡树叶的甲醇浸提物253.0 g，提取效率为25.3 %。将对节白蜡树叶的甲醇浸提物用蒸馏水溶解，然后选用极性从低到高的3种不同溶剂：石油醚、氯仿和乙酸乙酯依次萃取，每种溶剂用250 mL/次萃取3遍，各自合并，用旋转蒸发仪减压浓缩至无溶剂蒸出，置于通风橱内氮气吹干称重，得出对节白蜡树叶甲醇浸提物在不同极性溶剂中的分配率(表1)。

从表1可见，对节白蜡树叶甲醇浸提物在不同极性溶剂中的分配率有明显的差异，水层中物质最多，占总浸提物的66.0 %，说明水溶性高极性物质占主要成分；其次是乙酸乙酯萃取物，占总的17.8 %；石油醚萃取物和氯仿萃取物分别占总的11.5 %、4.8 %。

2.2 不同溶剂萃取物对供试病菌的活性测定

由表2可知，乙酸乙酯萃取物对供试菌有较好的活性，其中对苹果斑点落叶病和棉花红腐病的效果最好，抑制率分别达到78.0 %、69.0 %。其次石油醚萃取物对马铃薯早疫病的抑制率为55.0 %，对其他菌株的抑制活性非常低。氯仿萃取物和水层物质对供试病菌基本没有抑制作用。

2.3 乙酸乙酯萃取物初步分离组分对供试病菌的活性测定

表1 对节白蜡树叶甲醇浸提物在不同极性溶剂中的分配率Table 1 The distribution rate of methanol extractive of Fraxinus hupehensis leaves in different polarity solvents

表2 不同溶剂萃取物的杀菌活性Table 2 Fungicidal activities of different solvent extractives

表3 不同组分的杀菌活性Table 3 Fungicidal activities of different components

由表3可知，组分1和组分4整体表现出优于其他组分的杀菌活性，其中组分1对棉花红腐病、苹果斑点落叶病的抑制率分别达到70.0 %和79.0 %，组分4苹果斑点落叶病的抑制率也达到74.0 %。为有效成分的研究和确定锁定了范围，为研究对节白蜡的抗病原因打下了一定的基础。

3 讨 论

对节白蜡树叶甲醇浸提物中乙酸乙酯萃取物对供试菌的效果最好，其中苹果斑点落叶病和棉花红腐病的抑制率分别达到78.0 %和69.0 %。石油醚萃取物中，对马铃薯早疫病的抑制率为55.0 %，对其他的菌没有抑制活性。氯仿萃取物和水层中物质都没有抑制活性。进一步对乙酸乙酯萃取物初步分离组分进行杀菌活性测定，结果表明，组分1和组分4整体表现出优于其他组分的杀菌活性，其中组分1对棉花红腐病、苹果斑点落叶病的抑制率分别达到70.0 %和79.0 %，组分4苹果斑点落叶病的抑制率也达到74.0 %。但是试验中所用样品为对节白蜡的粗提物，还应对粗提物进一步分离提纯，确定其活性物质，为进一步的深入研究奠定基础。

4 结 论

随着农药的大面积使用，病虫对农药的抗性越来越高，并且由于人们对环境的重视，生物农药也进入人们的视野，我们期望可以从植物中找到一种新的化合物，可以有效的缓解病虫的抗性，和减少对环境的伤害。试验结果表明，对节白蜡提取物和初步分离组分对部分病菌具有一定的抑制效果，为有效成分的研究和确定锁定了范围，为研究对节白蜡的抗病原因打下了一定的基础，可以作为探寻生物农药的新尝试。

[1]曲式曾，向其柏，苏丕林.白蜡树属一新种——对节白蜡[J].南京林产工业学院学报,1979,2(1):146-147.

[2]曲式曾，向其柏，苏丕林.湖北白蜡树属一新种[J].植物分类学报,1980,18(3):366

[3]苏丕林，廖卉荣，胡功强，等.对节白蜡(Fraxinushupensischiushanget Su)种质资源的分布[J].湖北林业科技,1994,87 (1):35-41.

[4]彭辅松，李鸿钧.湖北省第二批国家珍稀濒危保护植物[J].武汉植物学研究,1990,18(4):383-385.

[5]苏丕林.珍贵的对节白蜡资源[J].植物杂志,1987,11(4):10.

[6]苏丕林，明 军，胡功强，等.对节白蜡资源开发综合利用价值与展望[J].湖北林业科技,1995,94(4):1-4.

[7]马 力，严慧娟，曲佳佳，等.高效液相色谱法测定对节白蜡中秦皮甲素的含量[J].医药导报,2010,29(4):525-527.

[8]马 力，严慧娟，曲佳佳，等.对节白蜡皮中秦皮甲素和秦皮乙素的含量测定方法[J].中国医院药学杂志,2010,30(15):1336-1337.

[9]程建如，周明芹.对节白蜡种质资源分布现状及保育策略[J].长江大学学报(自然科学版),2016,13(3): 7-9.

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[11]凌 冰，王国才，轧 霁，等.苦瓜叶提取物对小菜蛾的拒食活性及有效成分研究[J].中国农业科学,2008,41(10):3116-3122.

[11]向亚林，凌 冰，王国才，等.苦瓜茎叶中葫芦烷三萜化合物对小菜蛾幼虫的拒食作用[J].华南农业大学学报,2009,30(3):13-17.

[13]陈年春.农药生物测定技术[M].北京：北京农业大学出版社,1991:161-162.

StudyonFungicidalActivityofFraxinushupehensisExtractedfromItsLeaves

WU Qing-lai,ZHANG Liang-ju,XU Hui-hui,XU Zhi-hong,LI Jun-kai*

(School of Agricultural,Yangtze University,Hubei Jingzhou 434025,China)

【Objective】The present paper aims to study the cause of disease resistance ofFraxinushupehensisand explore new biology pesticide.【Method】The leaves ofFraxinushupehensiswere extracted and the fungicidal activities were tested in vitro.For locked active components further,the ethyl acetate extract was preliminarily separated by column chromatography and the fungicidal activities were tested in vitro.【Result】The bioassay results indicated that the ethyl acetate extract showed better fungicidal activities than other extract.In particular,the ethyl acetate extract showed bioactivity againstFusariumrotofcottonandAlternariaalternataf.sp.maliwith the rate of 78.0 % and 69.0 % at the concentration of 500 (g/mL).The bioassay results also indicated that component 1 and component 4 showed better fungicidal activities than other components.In particular,component 1 showed bioactivity againstFusariumrotofcottonandAlternariaalternataf.sp.maliwith the rate of 70.0 % and 79.0 % at the concentration of 500 (g/mL,component 4 also showed bioactivity againstAlternariaalternataf.sp.maliwith the rate of 74.0 % at the concentration of 500 (g/mL).【Conclusion】The extract ofFraxinushupehensisleaves showed a certain fungicidal activities against some fungi,that lay a certain foundation for studying the cause of disease resistance ofFraxinushupehensis.

Fraxinushupehensis; Extraction; Fungicide activity; Biology pesticide

1001-4829(2017)4-0978-03

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.043

2016-06-25

国家自然科学基金(30971948);湖北自然科学基金(2014CF 105)

吴清来(1977-)，男，湖南株洲人，讲师，研究方向为绿色新农药创制，Tel:15901666143，E-mail: wql106@163.com。

S792.41

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(责任编辑 李山云)