菩人丹调控ob/ob小鼠胰腺组织信号传导机制探索❋

陈 书，苏冷高娃，张耀丹，白颖慧，鲁碧楠，庞宗然

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

【实验研究】

菩人丹调控ob/ob小鼠胰腺组织信号传导机制探索❋

陈 书，苏冷高娃，张耀丹，白颖慧，鲁碧楠，庞宗然△

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

目的：应用信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片技术探索菩人丹调控ob/ob小鼠糖尿病前期病变，减缓T2DM进程的可能信号通路及具体调变位点。方法：以肥胖、胰岛素抵抗为特征的ob/ob小鼠为糖尿病前期模型，利用信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片分析筛选空白组、模型组及菩人丹干预组胰腺组织的磷酸化修饰差异蛋白。结果： 菩人丹干预组与模型组比较共筛选发现61个同空白组趋势一致的磷酸化修饰差异蛋白，PANTHER软件对其进行生物学功能分类，发现多参与机体的细胞过程、代谢过程、应激反应、生物调控、发育过程及免疫系统过程，DAVID软件进行Pathway通路富集，导入Cytoscape 3.2.1软件进行通路间关系网络互作分析，确认了ob/ob小鼠糖尿病前期的部分磷酸化修饰差异蛋白所涉及的关键通路。结论：菩人丹干预糖尿病前期病变，延缓T2DM病程发展，主要与胰岛素信号、mTOR信号通路、MAPK信号通路、凋亡、自噬通路及Ca2+通路等密切相关。

糖尿病前期；菩人丹；磷酸化修饰；信号通路调控

糖尿病前期(Pre-diabetes)又称为糖调节受损，以胰岛素抵抗和肥胖为主要病理表现[1]，是健康人群从正常糖调节迈向2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的必经之路。我国是糖尿病发病大国，尤以T2DM为主，除了约1.5亿的糖尿病患者，更有约5亿的“后备力量”糖尿病前期人群，若任其发展则迅即“转正”，此时加以干预，改善、逆转糖尿病前期病理状态，对T2DM的防控具有重要意义。

中药复方菩人丹是临床有效防控糖尿病的效验方剂，由苦瓜、人参、丹参、葛根、制首乌及制水蛭组成。实验研究证实，菩人丹在调节机体糖脂代谢、增强胰岛素敏感性等方面具有显著的作用和优势[2]，但因其组方成分较为复杂、作用路径和主要作用靶点尚不明确，亟需深入探究。

因此，本研究拟以自发性肥胖、胰岛素抵抗ob/ob小鼠为糖尿病前期模型，以菩人丹为研究载体干预12周，继以信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片技术，分析菩人丹干预糖尿病前期小鼠胰腺组织的磷酸化修饰调变的通路蛋白及参与调控的信号通路，结合生物学功能分析，探索中药复方菩人丹干预ob/ob小鼠糖尿病前期、减缓T2DM进程的可能信号通路及具体调变位点。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级C57BL-6J雄性小鼠10只，3周龄，体质量(9.70±0.80) g；SPF级雄性ob/ob小鼠20只，3周龄，体质量(9.88±2.00) g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供(许可证号SCXK(京)2014-0004)。实验小鼠均饲养于中国人民解放军总医院第一附属医院SPF级动物房，12 h/12 h光暗周期下，自由摄取食物和水。

1.2 主要药品及试剂

鲜苦瓜购于北京天地生有机食品有限公司；人参(北京同仁堂，批号 20150524)、制首乌(批号 140701)、丹参(批号 140601)、葛根(批号 140801)均购于北京亚威中药饮片有限公司；制水蛭(金香中药饮片有限公司，批号 14051001)；信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片试剂盒(Full Moon BioSystems公司，美国，PEX100)。

1.3 主要仪器

冷冻离心机(Thermo Scientific，美国)；酶标仪(PE Victor, PE，美国)；涡旋振荡器Vortex5(QILINBER，中国)；摇床TS-2(Kylin-Bell Lab Instruments，中国)；芯片小型离心机ChipMate PMC-082(Tomy，日本)；芯片扫描仪Gene Pix4000B(Axon Instruments，美国)。

2 方法

2.1 菩人丹制备方法

菩人丹组方中，除苦瓜和人参外，其余药材冷水浸泡2 h，10倍水回流提取2次，每次1.5 h；人参冷水浸泡过夜后，10倍水回流提取2次，每次2 h。过滤后收集提取液，将2次提取液混合于旋转蒸发仪中浓缩。鲜苦瓜去籽后由北京开元永盛冻干技术有限公司代加工为冻干苦瓜，打粉过100目筛，加入之前药材浓缩液中，蒸馏水补齐，制得菩人丹溶液(相当于生药量0.90 g·mL-1)。

2.2 分组及给药

实验动物于4周龄时分组，C57BL-6J为空白对照组，ob/ob小鼠按随机数字表法分为模型组和菩人丹组，每组10只，均饲以普通维持饲料。菩人丹组按照生药量9.00 g·kg-1灌胃给药，模型组和空白组给予同体积蒸馏水，各组均灌胃12周，每天1次。实验结束后，每组随机选取3只小鼠进行信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片检测。

2.3 蛋白样品处理

2.3.1 样品蛋白质抽提和标记 每只小鼠取绿豆大小新鲜胰腺组织胰尾部分，按照蛋白抽提试剂盒操作步骤进行，样品经芯片专用裂解液裂解后，采用BCA法测定各样品蛋白浓度，每组3个样品各取100 μg合成一管。样本分组编号为C组(空白对照组)、M组(模型组)、P组(菩人丹干预组)。每个样本各取25 μg蛋白样品进行标记，存储于-80 ℃备用。

2.3.2 芯片封闭、杂交及检测 将蛋白质芯片从冰箱取出，室温平衡45 min加入封闭溶液，确定芯片表面与条码向上，室温封闭45 min洗涤，而后缓慢地将Protein Coupling Mix(Coupling Solution中加入生物素标记的蛋白25 μg)加到芯片表面，室温在摇床上反应2 h，洗涤3次。将芯片没入加有Cy3-Streptavidin solution的Detection buffer中， 室温避光，在摇床上55 r/min反应20 min，洗涤3次，离心干燥芯片表面，扫描芯片。

2.4 芯片数据处理

扫描获取的芯片图像，使用Gene Pix Pro 6.0软件读取原始数据并进一步分析。PEX100芯片上含有1318种抗体，覆盖多个信号通路452个关键蛋白582个磷酸化位点，芯片上大部分抗体为配对抗体(1164个抗体)，即每个磷酸化位点有2个抗体，1个抗体识别该磷酸化位点的磷酸化状态，另一个抗体识别该位点的非磷酸化状态，具有配对抗体磷酸化位点的磷酸化水平计算是其磷酸化信号值与对应的非磷酸化信号值的比值。

3 结果

3.1 胰腺组织磷酸化修饰差异蛋白及其位点

图1表1显示，将C、P2组分别与M组进行比较，分别求得差异倍数，以1.5倍为cut off，筛选出2个比较组中磷酸化修饰水平共同显著上调的36个蛋白，磷酸化修饰水平共同显著下调的25个蛋白，计61个磷酸化修饰差异蛋白。将这61个磷酸化修饰差异蛋白的“Swiss-Prot”号上传至PANTHER软件，在数据库软件中映射到57个功能蛋白。

表1 胰腺组织磷酸化修饰差异蛋白及其位点

磷酸化修饰差异蛋白及其位点蛋白磷酸化修饰水平比值C/MP/MSwiss-ProtHDAC8(Phospho-Ser39)0.440.35Q9BY41c-PLA2(Phospho-Ser505)0.430.53P47712CDK1/CDC2(Phospho-Thr14)0.400.53P24941IR(Phospho-Tyr1361)0.400.33P35568FAK(Phospho-Ser910)0.380.40Q05397PECAM-1(Phospho-Tyr713)0.370.35P16284mTOR(Phospho-Thr2446)0.370.59P42345Caveolin-1(Phospho-Tyr14)0.360.52Q03135HCK(Phospho-Tyr410)0.310.31P08631Calsenilin/KCNIP3(Phospho-Ser63)0.240.57Q9Y2W7

3.2 胰腺组织磷酸化差异修饰蛋白聚类分析

图2显示，将61个磷酸化修饰差异蛋白进行聚类分析，横向代表不同的样本，纵向代表不同的蛋白，红色表示磷酸化修饰差异蛋白在分组样本中表达值高，绿色表示表达值低，图中的分叉越近说明相似度越高，距离越近。可见，空白对照组与模型组组间差异较大，但各自组内聚合度较好；菩人丹组与模型组组间差异也较大，且组内聚合度较好。此外，与模型组比较，菩人丹组与空白对照组胰腺组织蛋白的磷酸化修饰作用趋势较为一致，表明菩人丹有改善ob/ob小鼠糖尿病前期的作用趋势。

3.3 胰腺组织磷酸化修饰差异蛋白的通路富集及网络互作分析

将C、P2组分别与M组进行比较，筛选出61个磷酸化修饰差异蛋白，将这些蛋白的“Swiss-Prot”号在DAVID软件中进行Pathway通路富集，找出2个比较组中蛋白磷酸化修饰水平共同显著富集的信号通路，通过KEGG Pathway-Pathway Network构建，解析信号起始Pathway和终末Pathway，导入到Cytoscape 3.2.1软件中进行关系网展示，并计算不同Pathway在网络中的拓扑学距离，网络图中Node的大小与Pathway在网络中的拓扑学权重大小一致，Edge箭头指向信号下游传导的Pathway。如图3确认了ob/ob小鼠糖尿病前期的部分磷酸化修饰差异蛋白所涉及的关键通路，包括胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)、 mTOR信号通路(mTOR signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、凋亡通路(Apoptosis)和Ca2+通路(Calcium signaling pathway)等。

图2 胰腺组织磷酸化修饰差异蛋白的聚类分析

图3 胰腺组织磷酸化修饰差异蛋白富集的通路网络互作分析

4 讨论

中医对糖尿病前期并没有明确定义，一般认为“脾瘅”与糖尿病前期病变特征最为相似，关系最为密切。现存文献中，“脾瘅”一词最早出现于《素问·奇病论》：“此五气之溢也，名曰脾瘅……此肥美之所发也，此人必数食肥甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴。[3]”由此揭示了从肥胖到脾瘅再到消渴的自然发展过程，过食肥甘易致肥胖，乃“脾瘅”病理基础，肥甘厚腻积于中焦损伤脾胃，滋生痰湿与邪热，痰湿阻遏脾气升清，邪热燔灼津液，体内精微物质代谢循行逆乱，形成新的痰湿，新旧痰湿将进一步影响脾气升清，同时痰湿阻络、血行迟滞易致瘀血内停，这一过程除演变为“消渴”外，还可能发展为微血管、大血管病变相关的疾病。“脾瘅”是肥胖转化为各种代谢相关性疾病的重要过渡阶段，因此若能在“脾瘅”阶段发现且加以干预控制，可以大大提高患者的生存质量。

中医药具有数千年的临床应用历史，其治疗糖尿病的优势在于“早期干预”，即糖尿病前期。当机体出现糖调节受损时，胰岛素抵抗已经发生，中医药不仅可以降脂减肥，有效缓解胰岛素抵抗，在防治糖尿病的发生发展中更有着西药无可比拟的优势，避免西药长期服用导致的肝肾毒性及胃肠道不良反应等。

药物进入体内发挥药效的过程，是与受体、酶等蛋白质靶点相互作用的过程，蛋白质作为机体细胞活性及功能的最终执行者，磷酸化修饰是其发挥生理功能的重要基础，蛋白酪氨酸残基磷酸化或丝/苏氨酸残基磷酸化后调节下游蛋白活性，引起胞内一系列蛋白质的磷酸化产生级联效应，直至激活代谢酶、启动基因表达及产生细胞骨架变化等生理效应，参与调节细胞生长、增殖、分化等过程。本研究采用信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片(Phospho Explorer Antibody Microarray)，利用其针对每一个特定蛋白磷酸化位点，分别检测其磷酸化和非磷酸化状态，可以同时实现多条信号通路的筛选及具体调变位点定位的优势，试图解释中药复方菩人丹干预糖尿病前期有效的作用路径及调控位点。

肥胖是糖尿病前期的始动因素和病理基础，肥胖患者体内脂肪细胞增大、数量增多、游离脂肪酸及TNF-α、IL-6等脂肪细胞因子分泌增加，导致组织对胰岛素的敏感性下降，发生胰岛素抵抗。研究表明[4-6]，以肥胖、胰岛素抵抗为主要病理特征的糖尿病前期，其发病机理与胰岛素信号传导、mTOR信号传导、MAPK信号传导及凋亡、自噬等通路调控密切相关。

本实验中菩人丹干预后，首先IRS-1(Ser794)的磷酸化修饰水平上调，IR(Tyr1361)的磷酸化修饰水平下调，原因可能是菩人丹激活了AMPK，上调了AMPK1(Thr172)及其下游蛋白ACC1(Ser80)的磷酸化水平，从而增加了IRS-1 (Ser794)的磷酸化水平，抑制其酪氨酸位点的磷酸化，参与调控胰岛素信号传导通路；其次，mTOR(Thr2446)的磷酸化修饰水平下调，Thr2 446位点的磷酸化可以抑制Ser2448的磷酸化，导致mTOR活性降低，从而负向调控蛋白质转录[4]。菩人丹抑制mTOR(Thr2446)的磷酸化，上调EPB41 (Tyr418/660)的磷酸化水平，则可以激活mTOR信号传导通路，从而调控相关蛋白的合成及基因转录，促使β细胞数量增加和胰岛素分泌增强[6]；再次菩人丹上调c-Raf(Ser296)磷酸化水平，抑制Ras与Raf结合，下调MEK1(Thr291)磷酸化水平，促使Raf/MEK/ERK通路与凋亡相关通路相互作用，从而导致下游BAD(Ser112)磷酸化水平升高，可与14-3-3蛋白形成稳定的复合物，不能易位至线粒体外膜，不干扰同家族Bcl-xL与Bcl-2的抑制细胞凋亡活性[7]，抑制胰腺胰岛细胞的凋亡；同时p38MAPK、JNK及MSK1磷酸化激活后，可以作用于NFκB通路参与机体的炎症反应[8]。而T2DM是一个慢性炎症过程[9]，其发生发展与炎症反应密切相关。菩人丹干预后使IκB磷酸化降解，导致NFκB活化并转位入核，参与炎症免疫细胞趋化、浸润、活化等基因的调控及信号传递过程[10-12]，激活胰岛内免疫反应，对抗炎症。研究表明[10]，胰腺β细胞功能障碍与全身炎症状态相关，炎症可以激活胰岛内的免疫反应，使胰岛炎症减轻、β细胞功能得以改善。并且MAPK信号通路的激活还可以作用于Ca2+信号通路，增强β细胞对胰岛素的应答，促进β细胞的胞吐作用，从而调控胰岛素的分泌[13]。

此外，近年来研究表明[15-16]，自噬是T2DM及其并发症发生的潜在影响因素，T2DM状态下自噬激活增加，以减轻高血糖、高胰岛素血症造成的损伤。研究发现[17-18],Rab3A- / -糖尿病肥胖小鼠模型的胰岛β细胞中自噬激活增加，改变这种自噬激活状态，β细胞数量减少。本实验中，菩人丹升高AMPK1(Thr172)及其下游蛋白ACC1(Ser80)的磷酸化水平，可以促进自噬作用[14]，提示菩人丹可能也通过影响胰岛内自噬相关通路蛋白的磷酸化水平，从而保护及维持糖尿病前期ob/ob小鼠胰岛β细胞的数量、结构与功能，缓解机体胰岛素抵抗。

综上，本实验研究发现，菩人丹可能通过调控AMPK1(Thr172)、ACC1(Ser80)、IRS-1(Ser794)、IR(Tyr1361)、mTOR(Thr2446)、EPB41(Tyr418/660)、 c-Raf(Ser296)、MEK1(Thr291)、BAD(Ser112)、p38MAPK(Tyr182)、MSK1 (Ser360)、IκB-alpha (Tyr42)、NFκB-p65(Ser276)等蛋白的磷酸化修饰水平，从而调控胰岛素信号传导通路及其下游mTOR信号通路、MAPK信号通路、凋亡、自噬及Ca2+等通路，干预ob/ob小鼠糖尿病前期，调节脂代谢，增强胰岛β细胞的分泌作用，保护胰岛功能。菩人丹对上述蛋白磷酸化位点修饰的精确调控以及靶点通路的确定，有待于western blot实验及通路抑制剂干预实验进一步验证。

[1] AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J]. Diabetes Care, 2010, 3(1):S62.

[2] 庞宗然,赵玉堂,李静华,等. 菩人丹超微粉对肥胖型2型糖尿病大鼠糖代谢相关指标的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(5):107.

[3] 仝小林. 糖络杂病论[M]. 北京:科学出版社, 2010:18.

[4] 许戈阳,刘芬婷,沈哲民,等. mTOR信号通路在糖代谢中作用[J]. 生理科学进展, 2015(2):94.

[5] CHENG SW, FRYER LG, CARLING D, et al. Thr2446 Is a Novel Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Phosphorylation Site Regulated by Nutrient Status[J]. J Biol Chem, 2004, 279(16):15719.

[6] 何艳,叶庆林,林德馨,等. 胰岛素对NIH3T3细胞生长和Ras-MAPK信号途径的影响[J].福建医科大学学报, 2002, 36(2):130.

[7] 李捷萌,陈彦青,刘荣国. 线粒体凋亡途径与Bcl-2家族蛋白研究进展[J]. 医学综述, 2008, 14(4):489.

[8] YANG N, LIANG Y, YANG P, et al. TNF-α receptor antagonist attenuates isoflurane-induced cognitive impairment in aged rats[J]. Exp Ther Med, 2016, 12(1):463.

[9] 李桂林,梁尚栋. 趋化因子5及其受体CCR5与糖尿病并发症[J]. 中国药理学通报, 2011,27(10):1333.

[10] KAHN SE, COOPER ME, DEL PRATO S. Pathophysiology and treatment of type 2 diabetes: perspectives on the past, present, and future[J]. Lancet, 2014, 383(9922):1068.

[11] SCHMID H, BOUCHEROT A, YASUDA Y. Modular activation of nuclear factor-kappa B transcriptional programs in human diabetic nephropathy[J]. Diabetes, 2006, 55(11):2993.

[12] 石秀林,李芳萍,蔡梦茵,等. 新诊断2型糖尿病患者血清炎症因子及外周血单个核细胞中核因子κB活性变化[J]. 中山大学学报：医学科学版, 2006, 27(3):266.

[13] GÖKHAN S, HOTAMISLIGIL. Inflammation and metabolic disorders[J]. Nature, 2006,444(14):860.

[14] 葛军,张玉,郑增长,等. CREB转录因子及其磷酸化信号通路的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(30):16769.

[15] YAO F, ZHANG M, CHEN L. 5′-Monophosphate-activated protein kinase (AMPK) improves autophagic activity in diabetes and diabetic complications[J]. Acta Pharm Sin B, 2016, 6(1):20.

[16] 洪金妮,黎巍威,王学美. 自噬与2型糖尿病的关系及中药的干预作用[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(22):4351.

[17] CHEN ZF, LI YB, HAN JY, et al. The double edged effect of autophagy in pancreatic beta cells and diabetes[J]. Autophagy, 2011, 7(1):12.

[18] MARSH BJ, SODEN C, ALARCON C, et al. Regulated Autophagy Controls Hormone Content in Secretory-Deficient Pancreatic Endocrine β-cells[J]. Mol Endocrinol, 2007, 21(9):2255.

ExplorationofPuRenDanRegulationOfOb/ObSignalTransductionMechanismofMousePancreaticTissue

CHEN Shu, SULENG-GAO-WA, ZHANG Yao-dan, Bai Ying-hui, LU Bi-nan, Pang Zong-ran△

(InstituteofChineseMinorityTraditionalMedicine,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Objective: Phospho Explorer Antibody Microarray was applied to explore the signal transduction regulation mechanism ofPu-Ren-Danin ob/ob mice pancreas. Method: Setting the obesity and insulin resistant ob/ob mice as model. Pancreas from the blank group, the model group andPu-Ren-Dangroup were detected by Phospho Explorer Antibody Microarray. Result: Compared with model group, 61 different phosphorylated proteins were found inPu-Ren-Dangroup, which the variation trend was consistent with the blank group. Through the biological function analysis, the found 61 proteins were mainly involved in cellular process, response to stimulus, metabolic process, biological regulation, developmental process and immune system process. The Pathway-Act-Network was built according to the interactions with pathways identified in the KEGG database, including insulin signaling pathway, mTOR signaling pathway, MAPK signaling pathway, apoptosis, calcium signaling pathway etc. Conclusion: This may be one of the molecular mechanisms whichPu-Ren-Danintervenes in Pre-diabetes to regress the disease.

Pre-diabetes;Pu-Ren-Dan; reversible phosphorylation; signaling pathway regulation

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1229-05

国家自然科学基金资助项目(81273912)；国家自然科学基金青年基金资助项目(81302946)

陈 书(1989-)，女，辽宁营口人，在读博士，从事2型糖尿病病机与中医药干预研究。

庞宗然(1966-)，男，河北承德人，研究员，博士研究生导师，从事糖尿病及其并发症发病机制与中医药干预研究，E-mail: zrpang@163.com。

2017-03-12