铁皮石斛主要组分对慢性萎缩性胃炎模型大鼠的萎缩逆转作用及PCNA、Bcl-2蛋白的影响*

马津真 吴人照 龙华晴 聂晓静 陈 宇 戴关海 陈 璇 童晔玲 任泽明 杨芳亮

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053 2 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007 3 浙江天皇药业有限公司 浙江 杭州 310012

实验研究

铁皮石斛主要组分对慢性萎缩性胃炎模型大鼠的萎缩逆转作用及PCNA、Bcl-2蛋白的影响*

马津真1吴人照2#龙华晴1聂晓静1陈 宇2戴关海2陈 璇2童晔玲2任泽明2杨芳亮3

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053 2 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007 3 浙江天皇药业有限公司 浙江 杭州 310012

目的：探讨铁皮石斛及其两类主要组分铁皮石斛粗多糖、铁皮石斛非多糖对亚硝基胍（N-methyl-N'-nit ro-N-nit rosoguanidine，MNNG）诱发慢性萎缩性胃炎（Chronic Atrophic Gast ritis，CAG）模型大鼠的萎缩逆转作用及对PCNA蛋白、Bcl-2蛋白的影响。方法：Wistar大鼠自由饮用167μg/ml蒸馏水浓度的饮用液，实验造模12周。确定成模后，将大鼠分为模型组、铁皮石斛提取物组、铁皮石斛粗多糖组、铁皮石斛非多糖组，正常组。并分别给予药物治疗8周后，观察大鼠体重、胃组织病理组织学、胃组织PCNA、Bcl-2蛋白表达情况。结果：①体重：治疗第8周铁皮石斛组体重显著高于模型组，体重丢失有显著恢复（P＜0.05）；铁皮石斛粗多糖组、铁皮石斛非多糖组体重也显著高于模型组，体重丢失有显著恢复（P＜0.01）。②病理：铁皮石斛组腺体萎缩、主细胞、肠化较模型组显著减轻（P＜0.05，P＜0.01）；铁皮石斛粗多糖组腺体萎缩、主细胞、不典型增生、肠化显著减轻（P＜0.05，P＜0.01）；铁皮石斛非多糖组炎症（等级）、腺体萎缩、不典型增生、肠化显著减轻（P＜0.05，P＜0.01）。模型组雄1发生肿瘤，治疗各组未发生肿瘤。③PCNA蛋白、Bcl-2蛋白：铁皮石斛组、铁皮石斛粗多糖组、铁皮石斛非多糖组的PCNA蛋白较模型组均有显著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白较模型组有降低趋势。结论：铁皮石斛组、铁皮石斛粗多糖组、铁皮石斛非多糖组均对CAG模型大鼠具有良好的治疗作用，减轻体重丢失，减轻胃粘膜萎缩和肠化，其作用机理之一可能是通过下调胃黏膜PCNA蛋白、Bcl-2蛋白的高表达起到治疗作用。

铁皮石斛 石斛粗多糖 石斛非多糖 慢性萎缩性胃炎 PCNA蛋白 Bcl-2蛋白

CAG是胃黏膜上皮和固有腺体萎缩导致黏膜变薄甚至消失，黏膜肌层增厚的病理改变，并常伴有肠上皮化生、炎症反应及不典型性增生[1]，为消化系统常见病,且为胃癌前病变。胃癌很少从正常的胃黏膜上皮直接发生，通常需经历多年持续的癌前病变过程，从正常胃黏膜→慢性浅表性胃炎→CAG→肠化生→不典型增生→胃癌的发展模式。因此，对CAG进行干预，有效逆转胃癌前病变对降低胃癌发病率和病死率具有重要意义。近年来，我国胃癌发病率和病死率均呈上升趋势。西医治疗CAG尚无特效疗法，中医药治疗有一定优势[2]。本课题主要研究中药材铁皮石斛及其两类主要组分铁皮石斛粗多糖、铁皮石斛非多糖的药理作用，初步探讨其对PCNA蛋白、Bcl-2蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物：正常Wistar大鼠80只，雌雄各半，体重160～190g，动物合格证编号：0228546。均购买于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK(沪)2013-0016。实验动物均饲养于25±2℃的屏障实验室内，每12小时光照明暗交替，实验动物使用许可证号：SYXK(浙)20090122。

1.2 实验药物：铁皮石斛提取物组：生药量为0.25g/ml，批号：T01-150914。铁皮石斛粗多糖提取物组：生药量为0.25g生药/ml，批号：T01-150914-01。铁皮石斛非多糖提取物组：生药量为2.0g生药/ml，批号：T01-150914-02；以上药品均由浙江天皇药业有限公司提供。

1.3 实验仪器：RM2235 LEICA病理切片机、EG1150C LEICA生物组织冷冻机、EG1150H LEICA生物组织包埋机、ASP200 LEICA生物组织自动脱水机：德国莱卡公司；BX41OLYMPUS显微镜：日本OLYMPUS（オリンパス）株式会社；Nikon ECLIPSE Ti显微摄像系统：日本Nikon株式会社。全波长酶标仪：美国BioTek公司。

1.4 实验试剂：MNNG：5g/瓶，上海蓝季生物公司购买，由日本东京化成工业株式会社生产，批号：75F71-TF；甲醛溶液：500ml/瓶，上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20130610；BCA蛋白浓度测定试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司，批号：0226160511；PCNA蛋白、Bcl-2蛋白ELISA试剂盒：上海美旋生物技术公司，批号：201605。

1.5 MNNG诱发的CAG模型大鼠造模方法：6周龄的Wistar大鼠80只，雌雄各半，60只开始造模型：每周配167μg/ml浓度的MNNG饮用液，将其装入外用黑色塑料袋包裹着的水瓶，大鼠自由饮用。本次实验造模12周。

1.6 大鼠分组治疗：造模完成时，随机选取4只模型动物与4只正常动物胃组织做病理组织学检查，确定成模后，按照实验的分组要求（每组12只，雌雄各半）分组并开始给药。模型组给生理盐水，铁皮石斛提取物组给铁皮石斛提取物生药量0.67g/kg/d灌胃，铁皮石斛粗多糖组给铁皮石斛粗多糖提取物生药量0.67g/kg/d灌胃，铁皮石斛非多糖组给铁皮石斛非多糖提取物生药量0.67g/kg/d灌胃，此外，取12只相同条件的大鼠作为空白（未造模）对照组。在给药第8周完成时，5组大鼠均麻醉，迅速将胃摘出，用福尔马林固定，石蜡包埋，做4μm切片，用HE、AB染色，进行组织学检查。

1.7 病理组织学检查方法：标本：大鼠均麻醉，迅速将胃摘出，标本为全胃，上段留0.5cm食管，下段留1.5cm十二指肠；沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，浸于10%中性福尔马林中[3]。

取材范围：从前胃一直到十二指肠纵向全长、全层。包埋切片：石蜡包埋，作4μm切片。染色：HE染色、AB染色，按照相关要求操作。光镜观察：①胃黏膜炎症情况：采用半定量法。在胃组织的胃窦部取10个视野，具体参照在1994年美国休斯顿所提出的胃炎诊断标准。②胃黏膜腺体厚度：每张胃组织切片中，选取胃窦部黏膜5个视野，测出在每个视野下胃窦黏膜腺体厚度，得出每张切片5个视野平均值(μm)。③胃腺体数目：选取100倍镜下，找到每只大鼠胃组织的幽门环 0.2～1.2mm（200～1200μm）之间（即1mm范围）胃窦固有的腺体总个数，单位通常以“个/mm”来表示。④不典型增生：在每张切片中，取5个高倍镜视野，观察胃黏膜上皮细胞，明确有无细胞核多形性和腺体不典型增生的变化（采用轻、中、重级别报告）。⑤主细胞、壁细胞数目：选400倍镜下，取5个视野平均值，观察范围是每张切片的前胃和胃体部交界以下1.0mm开始的胃体部黏膜处。⑥肠上皮化生表现：参照《中药新药治疗慢性萎缩性胃炎的临床研究指导原则》及2006中国上海慢性胃炎共识意见。

1.8 胃组织PCNA、Bcl-2蛋白检测方法：将大鼠胃组织蛋白样品，按照PCNA、Bcl-2酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒说明书要求操作。

1.9 统计学方法：采用SPSS17.0统计软件进行统计，所有数据以均数±标准差（±s）来进行表示，多组均数比较采用F检验，其中两组比较计量资料采用LSD-t和Dunnet t T3检验方法检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05（或P＜0.01）为差异显著。

2 实验结果

2.1 体重：治疗前MNNG诱发的CAG模型大鼠体重167.77±38.23g，较正常大鼠体重259.42±51.93g显著下降（P＜0.01）。造模完成后，在治疗前各治疗组间体重情况是无显著性差异（P＞0.05），说明在各治疗组之间，其体重丢失的恢复疗效具有可比性。各治疗组MNNG诱发的CAG模型大鼠，治疗后体重较模型组的体重丢失有一定程度恢复。治疗第8周铁皮石斛提取物组大鼠体重203.83±27.55g，铁皮石斛粗多糖组大鼠体重218.08±22.13g，铁皮石斛粗非多糖组大鼠体重216.08±23.50g，三组均显著高于模型组体重171.08±32.23g，体重丢失有显著恢复（P＜0.01，P＜0.05）。数据见表1、图1。

治疗8周大鼠体重观察结果说明，铁皮石斛及其两类主要组分提取物对MNNG诱发的CAG模型大鼠均具有显著减轻体重丢失的疗效。

2.2 病理：铁皮石斛提取物组腺体数量42.83±7.51（个/mm）、腺体 厚度 290.40±42.61um、主 细 胞321.88±68.37（个/视野）、肠化（“++”“+++”只数）4/12（33.33%），与模型组腺体数量33.67±4.58（个/mm）、腺体厚度212.02±41.83um、主细胞205.75±118.12（个/视野）、肠化（“++”“+++”只数）10/12（83.33%）比较，有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。模型组还有1只动物（雄1号）发生肿瘤，为十二指肠浆膜面胃腺癌，其他各治疗组未发生肿瘤。数据见表2、表3。

铁皮石斛提取物的主要组分提取物组--铁皮石斛粗多糖提取物组腺体数量43.17±7.41（个/mm）、腺体厚度276.12±42.48um、主细胞290.91±92.36（个/视野）、轻度不典型增生 1/12（8.33%）、肠化（“++”“+++”只数）9/12（75%）；铁皮石斛提取物的主要组分提取物组--铁皮石斛非多糖提取物组炎症（等级）0.46±0.23、腺体数量 40.83±7.41（个/mm）、轻度不典型增生2/12（16.67%）、肠化（“++”“+++”只数）6/12（50%）。这两组铁皮石斛的主要组分提取物分别与模型组比较，上述指标也有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。

结合表1的体重丢失恢复疗效，以及模型组还有1只动物发生肿瘤，进行综合分析，铁皮石斛提取物组对MNNG诱发的CAG模型大鼠体重丢失恢复、萎缩逆转、肠化改善各方面有较好疗效，对炎症、不典型增生改善有一定作用。铁皮石斛的两类主要组分——铁皮石斛粗多糖提取物、铁皮石斛非多糖提取物各自单独应用组数据说明均对治疗效果有一定贡献。

表1 铁皮石斛组及其两类主要组分提取组对MNNG诱发的CAG模型大鼠治疗8周大鼠体重（±s,g/只）

表1 铁皮石斛组及其两类主要组分提取组对MNNG诱发的CAG模型大鼠治疗8周大鼠体重（±s,g/只）

注：与模型组比较，☆P＜0.05，★P＜0.01。

分组铁皮石斛组铁皮石斛粗多糖组铁皮石斛非多糖组正常组模型组例数12 12 12 12 12治疗前NRS评分170.08±27.87 165.50±30.85 170.50±32.96 259.42±51.93★167.77±38.23治疗第8周203.83±27.55☆218.08±22.13★216.08±23.50★292.83±61.88★171.08±32.23

图1 铁皮石斛组及其两类主要组分提取组对MNNG诱发的CAG模型大鼠治疗8周大鼠体重（单位：g/只）

表2 铁皮石斛组及其两类主要组分提取组对MNNG诱发的CAG模型大鼠治疗8周胃组织炎症萎缩病理观察（±s）

表2 铁皮石斛组及其两类主要组分提取组对MNNG诱发的CAG模型大鼠治疗8周胃组织炎症萎缩病理观察（±s）

注：与模型组比较，☆P＜0.05，★P＜0.01。

分组铁皮石斛组(n=12)铁皮石斛粗多糖组(n=12)铁皮石斛非多糖组(n=12)正常组(n=12)模型组(n=12)炎症 (等级)0.65±0.38 0.50±0.18 0.46±0.23☆0.23±0.20★0.88±0.38腺体数量(个/mm)42.83±7.51★43.17±7.41★40.83±7.41☆45.83±7.16★33.67±4.58腺体厚度(um)290.40±42.61★276.12±42.48★237.2±29.54 254.91±38.97☆212.02±41.83主细胞(个/视野)321.88± 68.37★290.91± 92.36☆249.41±106.87 319.42±121.35☆205.75±118.12壁细胞(个/视野)206.35±62.00 214.68±65.12 183.47±62.33 285.00±113.21★184.42±102.81

表3 铁皮石斛组及其两类主要组分提取组对MNNG诱发的CAG模型大鼠治疗8周胃组织不典型增生、肠化病理观察（只）

2.3 胃组织PCNA蛋白、Bcl-2蛋白表达检测：铁皮石斛提取物组PCNA蛋白5.26±2.62（μg/mg）、Bcl-2蛋白3.33±1.87（μg/mg）；铁皮石斛粗多糖提取物组PCNA蛋白 4.89±1.19（μg/mg）、Bcl-2蛋白 3.24±0.88（μg/mg）；铁皮石斛非多糖提取物组PCNA蛋白5.35±2.65（μg/mg）、Bcl-2蛋白3.30±1.59（μg/mg）；模型组PCNA蛋白8.22±3.43（μg/mg）、Bcl-2蛋白5.04±2.14（μg/mg）。铁皮石斛提取物组、铁皮石斛粗多糖提取物组、铁皮石斛非多糖提取物组胃组织PCNA蛋白较模型组均显著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白较模型组有降低，但5组之间的F检验未见显著性（P＞0.05）。数据见表4。

表4 铁皮石斛组及其两类主要组分提取组对MNNG诱发的CAG模型大鼠治疗8周胃组织PCNA、Bcl-2蛋白分析（±s，μg/mg）

表4 铁皮石斛组及其两类主要组分提取组对MNNG诱发的CAG模型大鼠治疗8周胃组织PCNA、Bcl-2蛋白分析（±s，μg/mg）

注：与模型组比较，☆P＜0.05。

分组铁皮石斛组铁皮石斛粗多糖组铁皮石斛非多糖组正常组模型组例数12 12 12 12 12 PCNA 5.26±2.62☆4.89±1.19☆5.35±2.65☆6.82±3.53 8.22±3.43 Bcl-2 3.33±1.87☆3.24±0.88☆3.30±1.59☆4.22±2.28 5.04±2.14

3 讨论

慢性萎缩性胃炎根据其临床症状与体征，可归属于中医学“胃脘痛”“痞满”等范畴，病机的关键在于脾胃虚弱，气机升降失常[4]。清代叶天士在《临证指南医案》中指出：“胃宜降则和，非用辛开苦降，亦非苦寒下夺，以损胃气，不过甘平或甘凉濡润以养胃阴，则津液来复，使之通降而已矣。”历代医家多有主张以养胃生津，促进通降为主要治法[5]。

石斛性微寒，味甘、淡，具有益胃生津、滋阴清热的功效。石斛在临床实践上常适用于阴虚型慢性萎缩性胃炎、慢性浅表性胃炎和慢性结肠炎等胃肠道病症。《本草求真》记载石斛“入脾肾，甘淡微苦、咸平，故能入脾，除虚热”；清代汪昂《本草备要》“（石斛）甘淡入脾，而除虚热”；《神农本草经》指出石斛“补五脏虚劳羸弱”之功效[6]。

铁皮石斛富含石斛多糖、石斛碱以及总氨基酸等多种成分，药效作用非常广泛，在提高人体免疫能力、抗衰老、抑制肿瘤、补五脏虚劳、改善糖尿病症状和慢性萎缩性胃炎等方面有明显疗效[7]。铁皮石斛的主要成分之一石斛粗多糖具有提高免疫力、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等广泛的生物学活性，具有低毒、不良反应少等特点[8]。石斛多糖可以减弱脂多糖引起巨噬细胞促炎细胞因子的释放[9]。传统认为多糖为铁皮石斛主要药效成分，而对非多糖关注相对较少。有研究证实铁皮石斛茎非多糖成分不仅在体内具有较强的抗氧化活性，在体外也具有抗氧化活性。在清除ABTS自由基方面，铁皮石斛茎非多糖更是优于粗多糖[10]。

增殖细胞核抗原（PCNA）是DNA复制合成过程中的必需蛋白，是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，其表达合成密切反映细胞的增殖动力变化，而阳性表达更表明细胞是处于活跃的增殖状态。B细胞淋巴瘤基因（Bcl-2）是一种亲脂性膜蛋白，是一种原癌基因。主要通过阻断细胞凋亡的公共信号传递通路，抑制或阻断多种细胞凋亡，延长细胞寿命。胃黏膜处于细胞增殖与凋亡失衡状态是在慢性萎缩性胃炎模型大鼠中普遍存在的现象。本研究发现模型组大鼠胃组织PCNA、Bcl-2蛋白表达升高，经药物干预后，铁皮石斛提取物组及其两类主要组分提取组PCNA、Bcl-2蛋白表达降低。表明铁皮石斛提取物组及其两类主要组分提取组可能通过下调PCNA、Bcl-2蛋白表达，促使胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡平衡，改善乃至逆转CAG的病理状态。也可能与其干预治疗CAG的病理状态恢复后胃组织的PCNA、Bcl-2蛋白过高表达自然回落有关。

铁皮石斛及其两类主要组分治疗MNNG诱发慢性萎缩性胃炎模型大鼠具有显著减轻体重丢失、改善胃组织腺体萎缩、不典型增生、肠化，下调PCNA、Bcl-2蛋白的高表达，阻止向癌前病变进一步发展，促使病变胃黏膜恢复正常，起到改善乃至逆转慢性萎缩性胃炎的作用。其中两类主要组分铁皮石斛粗多糖和铁皮石斛非多糖均有一定的疗效贡献。

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[5]王春才.叶天士治胃法探析[J].四川中医,1993,12(9)：6-7.

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[9]李小琼,金徽,葛晓军,等.金钗石斛多糖对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞分泌TNF-α NO的影响[J].安徽农业科学,2009,37(28)：13634-13635.

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国家科技重大专项重大新药创制项目铁皮枫斗颗粒治疗慢性萎缩性胃炎的临床研究，编号：2016ZX09101069；浙江省自然科学基金项目铁皮枫斗颗粒有效成分治疗慢性萎缩性胃炎的分子机理实验研究，编号：LY15H280011；浙江省重大科技专项项目铁皮枫斗颗粒治疗慢性萎缩性胃炎研究——扩大适应症研究，编号：2009C13032。

# 通讯作者：吴人照，E-mai l：wufeng03@126.com

2017-04-17