药食合用对围绝经期综合征模型大鼠神经—内分泌—免疫网络细胞凋亡及ER表达的影响

2017-10-19宋雨菊桑锋

中外医疗 2017年22期

宋雨菊　桑锋

[摘要] 目的观察更年滋肾汤合玉女酥对雌性去势大鼠下丘脑、垂体、子宫、胸腺、脾脏细胞凋亡及ER表达的影响，从神经-内分泌-免疫网络探讨药食合用治疗围绝经期综合征的作用机制。方法采取双侧卵巢切除法建立围绝经期综合征大鼠模型，2015年10月—2016年4月，选取上海斯莱克实验动物中心健康、12周龄、雌性未孕SD大鼠60只，隨机分为正常对照组、模型组、中药（更年滋肾汤）组、食疗（玉女酥）组、药食合用组，每组12只。给药（食）6周后，处死大鼠取丘脑、垂体、子宫、胸腺、脾脏组织，检测如下指标：TUNEL方法检测细胞凋亡率； Western blot技术检测ERα蛋白的表达变化；Real time PCR方法检测ERα mRNA的表达变化。结果 ①细胞凋亡率变化：下丘脑、垂体各组差异无统计学意义；模型组子宫（13.12±0.066）明显高于对照组（3.28±0.075），中药组（6.35±0.038）、药食合用组（4.90±0.034）明显低于模型组；模型组胸腺（3.46±0.215）明显高于对照组（1.70±0.045），中药组（2.51±0.038）、药食合用组（2.18±0.034）明显低于模型组；模型组脾脏（4.05±0.205）明显高于对照组，中药组（2.15±0.115）、药食合用组（1.64±0.082）明显低于模型组；差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。②ERα蛋白表达变化：各组织模型组明显低于正常组（P<0.05）；除胸腺外，其他组织中药组、药食合用组均明显高于模型组（P<0.05，P<0.01）。③ERα mRNA表达变化：模型组垂体（0.210±0.012）、下丘脑（0.197±0.015）、子宫（0.168±0.016）、脾脏（0.137±0.016）明显低于对照组（P<0.05）；中药组垂体（0.458±0.026）、下丘脑（0.410±0.028）、子宫（0.367±0.037）、脾脏（0.301±0.025）高于模型组（P<0.05）；食疗组子宫（0.349±0.021）、脾脏（0.282±0.018）高于模型组（P<0.05）；药食合用组垂体（0.523±0.025）、下丘脑（0.488±0.024）、子宫（0.743±0.042）、脾脏（0.723±0.069）高于模型组（P<0.05）。结论药食合用（更年滋肾汤合玉女酥）可通过影响雌性去势大鼠下丘脑、垂体、子宫、胸腺、脾脏细胞凋亡及ER表达，调节神经-内分泌-免疫网络，从而改善围绝经期综合征。

[关键词] 围绝经期综合征；神经-内分泌-免疫网络；药食合用

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）08（a）-0022-04

[Abstracts] Objective This paper tries to observe the effect of Gengnianzishen Decoction and Yunv crisp on the apoptosis and the expression of ER of hypothalamus， pituitary， uterus， thymus， spleen of ovariectomized female rat， and explore the mechanism of drug-food combination in the treatment of peri menopausal syndrome from the neuroendocrine immune network. Methods The bilateral ovariectomy was used to establish the perimenopausal syndrome rat model. 60 health， 12 week old female SD rats from October 2015 to April 2016 were selected from Shanghai SLRC Animal Laboratory Center， and were randomly divided into the control group， model group， Chinese medicine （Gengnianzishen Decoction） group， diet therapy （Yunv crisp） group and drug-food combination group， with 12 cases in each group. After treating drugs （food） for continuous 6 weeks， the rats were killed and their hypothalamus， pituitary， uterus， thymus， spleen were taken out and used to detect the following indicators： the cell apoptosis rate was detected by TUNEL method； the expression of ER alpha protein by Western blot； expression of ER alpha mRNA by Real time PCR. Results ①The apoptosis rate changes： there was no significant difference in hypothalamus and pituitary between the groups； the uterus of model group was （13.12±0.066） significantly higher than the control group of （3.28±0.075）， Chinese medicine group of （6.35±0.038）， drug-food combination group of （4.90±0.034）， significantly lower than that of model group； the thymus of the model group was （3.46±0.215）， significantly higher than the control group of （1.70±0.045）， Chinese medicine group of （2.51±0.038）， drug-food combination group of （2.18±0.034）， significantly higher than that of model group； the spleen of the model group was （4.05±0.205）， significantly higher than the control group， Chinese medicine group was （2.15±0.115）， drug-food combination group of （1.64±0.082）， significantly higher than that of model group （P<0.01，P<0.05）. ②Expression of ER alpha protein： the model group decreased more significantly than the control group （P<0.05）； except for the thymus， Chinese medicine group， food and drug combination group were increased significantly than the model group （P<0.05， P<0.01）. ③expression of ER alpha mRNA： hypothalamus was （0.197±0.015）， pituitary was （0.210±0.012）， uterus was （0.168±0.016）， spleen was （0.137±0.016） of the model group， decreased significantly than the control group （P<0.05）； hypothalamus was （0.410±0.028）， pituitary was （0.458±0.026）， uterus was （0.367±0.037）， spleen was （0.301±0.025） of the Chinese medicine group， increased significantly compared with the model group （P<0.05）； The uterus （0.349±0.021） and spleen （0.282±0.018） were higher than the mooled grap（P<0.05） hypothalamus was （0.488±0.024）， pituitary was （0.523±0.025）， uterus was （0.743±0.042）， spleen was （0.723±0.069） of the food and drug combination group， increased significantly compared with the model group （P<0.05）. Conclusion The combination of medicine and food （Gengnianzishen Decoction and Yunv crisp） can affect the apoptosis and expression of ER in hypothalamus， pituitary， uterus， thymus， spleen of ovariectomized female rat， regulating network in rats with perimenopausal syndrome， so as to improve perimenopausal syndrome.endprint

[Key words] Perimenopausal syndrome； Neuroendocrine immune network； Drug-food combination

围绝经期综合征在围绝经期妇女发病率80%以上，其中有25%的妇女症状严重，极大地影响了其身心健康、工作和家庭生活质量[1-3]。近年来，神经-内分泌-免疫网络已成为围绝经期综合征发病机制研究的热点。中医药治疗围绝经期综合征有着数千年历史，并且以疗效好、不良反应小有着独特优势[4]。多数医家认为该病主要临床症状皆源于肾虚，肾虚乃该病之主要病机，治法以补肾为根本。2015年10月—2016年4月，该研究选取上海斯莱克实验动物中心健康、12周龄、雌性未孕SD大鼠60只，该研究选择治疗围绝经期综合征的中医经验方更年滋肾汤，结合食疗古方玉女酥，观察药食同用对雌性去势大鼠下丘脑、垂体、子宫、胸腺、脾脏细胞凋亡及雌激素受体（ER）表达的影响，从神经-内分泌-免疫网络探讨药食合用治疗围绝经期综合征的作用机制，为围绝经期综合征的预防、治疗及康复提供客观依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

清洁级健康SD大鼠60只，体重（250±10）g，雌性，由上海斯莱克实验动物中心提供，饲养于南京中医药大学动物房，室温18～22℃，相对湿度65%。更年滋肾汤药物及其水煎剂均由北京同仁堂提供。玉女酥充分拌匀后混入鼠饲料中（其中玉女酥占50%）。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒，由南京凯基生物工程有限公司提供。ERα抗体，购自美国santa Cruze公司；β-actin抗体，购自德国Calbiochem公司；羊抗兔IgG，购自美国Sigma公司。Trizol、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购于大连宝生物工程有限公司。

1.2 造模与分组

大鼠适应性喂养1周后，以3.5%水合氯醛溶液麻醉大鼠，行双侧卵巢切除术。第6天开始采用阴道涂片法观察动情周期，阴道脱落细胞角化指数<50%且无动情周期性变化（符合更年期特征）者，为造模成功大鼠。对照组大鼠手术暴露卵巢但不切除。大鼠分为对照组、模型组、中药组、食疗组、药食合用组，对照组和模型组灌胃生理盐水，食疗组按正常食量喂以含玉女酥的饲料，中药组灌胃更年滋肾汤水煎液，药食合用组用更年滋肾汤灌胃的同时喂以含玉女酥的饲料，连续给药（食）6周后，禁食取材。

1.3 指标检测

大鼠处死后，立即取出下丘脑、垂体、子宫、胸腺、脾脏，TUNEL细胞凋亡试剂盒检测各组织细胞凋亡率，Western Blot技术检测各组织ERα蛋白的相对表达量，Realtime PCR技术检测各组织ERα mRNA表达量。

1.4 统计方法

数据采用SPSS 17.0统计学软件分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠垂体、下丘脑、子宫、胸腺、脾脏细胞凋亡率变化

结果显示，垂体、下丘脑细胞凋亡率各组差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组比较，模型组大鼠子宫、胸腺、脾脏细胞凋亡率显著升高（P<0.01）；与模型组比较，中药组、药食合用组子宫、胸腺、脾脏细胞凋亡率显著降低（P<0.05），药食合用组尤为明显。见表1。

2.2 各组大鼠垂体、下丘脑、子宫、胸腺、脾脏ERα蛋白水平变化

结果显示，各组织模型组明显低于正常组（P<0.05）；除胸腺外，其他组织中药组、药食合用组均明显高于模型组（P<0.05，P<0.01）。见图1。

2.3 各组大鼠垂体、下丘脑、子宫、胸腺、脾脏ERα mRNA水平变化

结果显示，除胸腺外，其他组织模型组明显低于对照组（P<0.05），各用药组均高于模型组，部分脏器差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

中醫认为，妇女在围绝经期，肾气渐衰，天癸将竭，冲任二脉随之亏虚，肾虚是围绝经期综合征的根本病机，治当补益肾气，然既不能单纯温肾助阳，也不可一味滋阴泻火，而应阴阳双调，“温肾补阳、滋阴降火”并用，使肾之阴阳趋于平衡[5-7]。更年滋肾汤由仙茅、仙灵脾、巴戟天、炒黄柏、炒知母、补骨脂、当归、制附子、生熟地、炙升麻、制黄精、炒枣仁组成，诸药合用，阴中求阳、阳中求阴，最终达到温补肾阳、滋阴降火的目的。玉女酥出于清代“玉女补乳酥”，由黄豆、花生、红枣等量组成。食疗与药物治疗相结合，相得益彰，药借食威，食助药力，药食合用可发挥更好的效果，以药食同用的方法防治疾病，是中医学的突出特色之一。

胸腺、脾脏是机体主要免疫器官，以往研究已证实，性激素对免疫细胞凋亡有调节作用，而生理水平的雌激素则可保护免疫细胞免于凋亡[8]。杨琳[9]研究发现，二仙汤及其拆方均可抑制卵泡颗粒细胞的调亡，其机制与调控凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase表达水平相关[9]。该研究发现去势大鼠子宫、胸腺、脾脏细胞凋亡率明显升高，药物干预后，中药组、食疗组、药食合用组细胞凋亡率明显降低，且药食合用组降低尤为明显。当雌激素减少时，这些组织和器官就会发生退行性病变或代谢改变，导致围绝经期妇女在精神、心理和神经内分泌等多个系统出现不平衡。唐苾芯等[10]研究发现，滋阴补肾方可明显提高血清雌激素水平，并对外周血单个核细胞中雌激素α受体（ERα）水平及其与雌激素β受体（ERβ）的比值有显著影响。张帆等[11-12]研究表明，自拟更年汤治疗围绝经期综合征肾阳虚证可能与提高下丘脑ER表达、促进卵巢内卵泡发育、抑制卵巢颗粒细胞及肾上腺皮质Bax蛋白表达水平有关。该研究结果发现，大鼠去势以后，ERα蛋白及mRNA表达明显降低，药物治疗后，中药组、药食合用组子宫和脾脏细胞ERα表达水平有显著升高，提示其可以在一定程度上改善去势大鼠子宫、脾脏的ERα表达水平。endprint

综上所述，药食合用治疗疾病是中医学的一个突出特点。“药食同源”“医食同源”，食品用在妙处，确有药品之功，每种疗效食物中所含的营养素是其产生药理作用的物质基础。诊病之后，“药以祛之，食以随之”，对于围绝经期综合征采用食疗与药物治疗相结合，相得益彰，药借食威，食助药力，药食合用可发挥更好的效果。该研究结果表明更年滋肾汤合玉女酥可通过影响雌性去势大鼠下丘脑、垂体、子宫、胸腺、脾脏细胞凋亡及ER表达，增强E-ER生物学效应，调节神经-内分泌-免疫网络，从而改善围绝经期综合征，但确切的作用过程尚需进一步验证。

[参考文献]

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[2] 李妤，李芳，郝友瑛，等.女性围绝经期综合征影响因素的调查研究[J].中国妇幼保健，2015，30（7）：1096-1098.

[3] 马堃，陈燕霞.中西医治疗围绝经期综合征策略的探讨[J].中国中药杂志，2015，40（20）：3899-3906.

[4] 蒋彩荣，吴昆仑.围绝经期综合征中医药治疗研究进展[J].山东中医杂志，2016，35（12）：1096-1020.

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[6] 辛卫云，白明，苗明三，等.浅析补肾阳中药治疗围绝经期综合征[J].中医学报，2017，32（1）：67-70.

[7] 朱玲桂.围绝经期综合征中医证候分布规律及病机特点研究[D].兰州：甘肃中医药大学，2016.

[8] 姚婷.补肾舒更汤配合利维爱治疗围绝经期综合征肾阴阳两虚证的临床观察[D].长沙：湖南中医藥大学，2016.

[9] 杨琳.温补肾阳中药治疗围绝经期综合征作用机理探讨[D].南京：南京中医药大学，2016.

[10] 唐苾芯，吴昆仑，都乐亦，等.滋阴补肾方对围绝经期综合征患者雌激素及雌激素受体的影响[J].上海中医药大学学报，2016，30（2）：27-30.

[11] 张帆，武创新，曹俊岩，等.自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠下丘脑雌激素受体及肾上腺皮质Bax、Bcl-2蛋白表达的影响[J].中医杂志，2016（21）：1864-1868.