光谱法结合分子模拟技术研究磺胺甲恶唑与左氧氟沙星的协同作用

周 雪， 张国文， 曾 霓

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047)

磺胺甲恶唑(SMZ)仍然是目前医学和兽医学临床常用的五种磺胺类药物之一，主要用于预防和治疗细菌感染性疾病[1]。左氧氟沙星(LVFX)是一种喹诺酮类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌作用强的特点[2]。据报道，磺胺类药物和喹诺酮类抗生素的联合使用可提高治疗效果。人血清白蛋白(HSA)是人体血浆中含量最丰富的载体蛋白，能与许多内源、外源性小分子物质结合[3]，这种结合能够明显影响小分子物质在人体血液中的吸收、分布和代谢[4]。余燕敏等[5]利用多种光谱法，研究了Fe3+存在下SMZ与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的结合常数和主要驱动力，以及SMZ对BSA构象的影响。陈玉海等[6]采用荧光和紫外光谱法，研究了LVFX与HSA的相互作用机制。但SMZ与LVFX共存时与蛋白质的相互作用尚未见报道，这两种药物共存是否产生协同作用也不清楚。

本文在人体生理酸度(pH=7.4)条件下，联合采用荧光光谱、紫外光谱及分子模拟技术，研究SMZ、LVFX两种药物单独或共存时与HSA的相互作用，为揭示SMZ、LVFX在人体内的分布、贮存、代谢及药效提供参考。

1 实验部分

1.1 实验仪器及试剂

F-4500型荧光光度计(日本，日立公司)；UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；MOS 450型圆二色谱仪(法国，Bio-Logic公司)；Nicolet-5700红外光谱仪(美国，尼高力公司)；pHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。

HSA(纯度≥97%，分子量为66 478 Da，Sigma公司)用pH=7.4的Tris-HC1缓冲液配制成浓度为4.0×10-7mol·L-1的工作液；SMZ(Sigma公司)用无水甲醇配制成浓度为5.0×10-3mol·L-1的储备液；LVFX(中国药品生物制品检定所)用超纯水配制成浓度为5.0×10-3mol·L-1的储备液；洋地黄毒苷(Sigma公司)、布洛芬和华法林(中国药品生物制品检定所)分别用乙醇配成浓度为2.0×10-4mol·L-1的储备液；上述溶液保存于4 ℃冰箱中备用，其他试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1紫外吸收光谱测定在温度25 ℃下，分别测定HSA、SMZ、LVFX、HSA-SMZ(或HSA-LVFX)体系及其三元体系的紫外光谱，扫描波长范围200～380 nm。

1.2.2荧光光谱测定分别移取3 mL 4.0×10-7mol·L-1HSA溶液于石英荧光池中，二元体系的测定：逐次加入一定量(5 μL/次)浓度为1.0×10-3mol·L-1SMZ溶液(或LVFX溶液)；三元体系的测定：先加入一定量(5 μL)浓度为5.0×10-3mol·L-1SMZ溶液(或LVFX溶液)，再逐次加入一定量(5 μL/次)浓度为1.0×10-3mol·L-1LVFX溶液(或SMZ溶液)，混匀，静置3 min，以280 nm和295 nm为激发波长，测定290～500 nm范围的发射光谱。在25 ℃下，分别进行△λ为15 nm和60 nm的同步荧光扫描。

1.2.3分子模拟研究采用Autodock4.2软件结合Lamarckian Genetic Algorithm算法进行处理分析，HSA的晶体结构来自Protein Data Bank数据库(www.rcsb.org)，pdb编号为lh9z，配体分子SMZ和LVFX的3D结构由Sybyl×1.1(USA)软件绘出，然后在MMFF94力场使用MMFF94电荷将其能量最小化。

2 结果与讨论

2.1 药物与HSA的结合常数

图1A显示，SMZ-LVFX体系的紫外光谱与SMZ和LVFX的加和光谱(SMZ+LVFX)几乎重叠，表明这两种药物不发生相互作用[7]；图1B显示，SMZ与HSA、HSA-LVFX体系作用的紫外光谱，可见HSA-SMZ体系的吸收强度小于SMZ与HSA叠加的光谱强度(HSA+SMZ)，表明SMZ与HSA发生了相互作用[8]；从图1C中也发现类似现象，表明SMZ与HSA-LVFX，LVFX与HSA及HSA-SMZ发生了相互作用。

图1 紫外-可见吸收光谱图Fig.1 UV-Vis absorption spectracHSA=4.0×10-7 mol·L-1;cSMZ=8.3×10-4 mol·L-1;cLVFX=8.3×10-4 mol·L-1;T=298 K, pH=7.4.

图2为25 ℃下，HSA-SMZ、HSA-LVFX、[(HSA-LVFX)-SMZ]和[(HSA-SMZ)-LVFX]体系的荧光发射光谱，随着SMZ、LVFX浓度的不断增加，HSA的荧光逐渐被猝灭，表明SMZ、LVFX均与HSA发生了相互作用[9]。根据Stern-Volmer方程[10]和修正后的Stern-Volmer方程[11]分别求得不同温度下药物与HSA作用的猝灭常数KSV和结合常数Ka(表1)。KSV随温度的升高而降低，且Kq均达到1012数量级，远高出最大扩散碰撞猝灭速率常数2.0×1010L·mol-1·s-1，表明SMZ、LVFX猝灭HSA的荧光为形成复合物的静态猝灭[12]。随着温度的升高，Ka呈现降低的趋势，表明温度升高，两种药物与HSA形成的复合物稳定性降低且呈现放热反应特征[13]。结合位点数n近似等于1，表明SMZ、LVFX在HSA上只有一个结合位点。Ka(HSA-LVFX)>Ka(HSA-SMZ)，显示出LVFX结合HSA的能力比SMZ强，表明SMZ在血液中的游离浓度要大于LVFX。Ka[(HSA-SMZ)-LVFX]

图2 荧光光谱图Fig.2 Fluorescence spectracHSA=4.0×10-7 mol·L-1;(A)HSA-SMZ,(C)[(HSA-LVFX)-SMZ]:cLVFX=8.3×10-4 mol·L-1,cSMZ(×10-5 mol·L-1);a→k:0,0.17,0.33,0.50,0.66,0.83,0.99,1.15,1.32,1.48,1.64;(B)HSA-LVFX,(D)[(HSA-SMZ)-LVFX]:cSMZ=8.3×10-4mol·L-1,cLVFX(×10-5 mol·L-1);a→k:0,0.17,0.33,0.50,0.66,0.83,0.99,1.15,1.32,1.48,1.64;both the excitation and the emission slits were set at 5.0 nm,T=298 K,pH=7.4.

SystemT/(K)KSV/(×104 mol·L-1)RaKa/(×104 L·mol-1)nRb△H/(kJ·mol-1)△S/(J·mol-1·K-1)△G(kJ·mol-1)HSA-SMZ2981.890.99832.681.030.9998-21.8811.37-25.263041.670.99932.251.060.9991-25.333101.490.99861.901.050.9999-25.40HSA-LVFX2983.410.99864.501.070.9994-22.3714.03-26.553043.290.99923.771.020.9995-26.643103.040.99913.171.030.9998-26.72[(HSA-LVFX)2981.330.99920.841.080.9997-16.5119.70-22.38-SMZ]3041.090.99870.731.000.9997-22.503100.910.99940.651.030.9993-22.61[(HSA-SMZ)2982.680.99922.141.010.9999-20.0515.67-24.72-LVFX]3042.470.99861.841.040.9996-24.813102.300.99911.571.050.9997-24.90

Rais the correlation coefficient for theKSVvalues；Rbis the correlation coefficient for theKavalues.

图3 激发波长为280 nm和295 nm时HSA的荧光猝灭曲线Fig.3 Comparison of the quenching curves of HSA excited at 280 and 295 nm(A)HSA-SMZ;(B)HSA-LVFX;(C)[(HSA-LVFX)-SMZ];(D)[(HSA-SMZ)-LVFX];both the excitation and the emission slits were set at 5.0 nm,T=298 K,pH=7.4.

当激发波长为280 nm时，HSA的荧光主要来自于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)残基，而激发波长为295 nm时，HSA的荧光主要由色氨酸(Trp)残基产生[15]。图3显示在HSA-SMZ体系中，不同激发波长下HSA荧光猝灭曲线几乎没有变化，表明只有Trp残基参与SMZ和HSA的相互作用[11]，而对于[(HSA-LVFX)-SMZ]体系，HSA荧光猝灭曲线明显改变，表明在LVFX的存在下，Trp和Tyr残基均参与SMZ和HSA的相互作用，即LVFX对SMZ与HSA相互作用产生明显影响[15]。HSA-LVFX和[(HSA-SMZ)-LVFX]体系中，HSA荧光猝灭曲线都发生了明显变化，表明不管SMZ是否存在，Trp和Tyr残基均参与LVFX与HSA的相互作用。

2.2 作用力类型

2.3 结合位点

研究表明，小分子药物在HSA上主要有两个结合位点，分别位于亚域、ⅡA与ⅢA的疏水腔中，即Site Ⅰ与Site Ⅱ，药物华法林、布洛芬分别结合在HSA的Site Ⅰ和Site Ⅱ，洋地黄毒苷被证实结合在与Site Ⅰ和Site Ⅱ无关的Site Ⅲ位[17]。本研究选取这3种药物为位点探针，通过竞争取代实验测定药物在HSA上的结合位点。图4显示在HSA-SMZ、HSA-LVFX及HSA-SMZ-LVFX三个体系中，随着SMZ或LVFX浓度的增加，华法林存在时体系的荧光强度变化均最明显，而布洛芬和洋地黄毒苷存在下体系的荧光强度变化趋势都相对较弱，表明SMZ、LVFX与华法林发生了置换反应，即SMZ、LVFX与华法林有相同的结合位点，主要结合在HSA的Site Ⅰ位[11]。SMZ、LVFX与HSA结合位点相同，也表明二者共存与HSA作用的协同性[14]。

图4 位点探针对(A)HSA-SMZ,(B)HSA-LVFX和(C)HSA-SMZ-LVFX体系的影响Fig.4 Effects of site markers on the fluorescence of (A)HSA-SMZ,(B)HSA-LVFX and (C)HSA-SMZ-LVFX systemscHSA=cWarfarin=cIbuprofen=cDigitoxin=4.0×10-7 mol·L-1;(A):cSMZ(×10-5 mol·L-1);a→k:0,0.17,0.33,0.50,0.66,0.83,0.99,1.15,1.32,1.48,1.64;(B):cLVFX(×10-5 mol·L-1);a→k:0,0.17,0.33,0.50,0.66,0.83,0.99,1.15,1.32,1.48,1.64;(C):cSMZ=cLVFX(×10-6 mol·L-1);a→k:0,0.83,1.66,2.49,3.31,4.13,4.95,5.77,6.58,7.39,8.20;both the excitation and the emission slits were set at 5.0 nm,T=298 K,pH=7.4.

2.4 分子模拟

分子模拟技术能直观描述小分子与蛋白质的结合模式和作用位点。能量最低时药物与HSA的分子模拟结果(图5)显示，在HSA-SMZ、HSA-LVFX、[(HSA-SMZ)-LVFX]和[(HSA-LVFX)-SMZ]体系中，SMZ、LVFX都是结合在HSA亚域IIA的疏水空腔Site I位，这与荧光竞争实验结果一致。在HSA-SMZ和HSA-LVFX体系中，SMZ与Leu198、Phe206、Phe211、Trp214和Leu481等氨基酸残基发生疏水作用，并与Ser202残基形成氢键；而LVFX分子与Phe156、Phe157、Ala191、Trp214和Ala291等氨基酸残基发生疏水作用，且与Arg218残基形成氢键，表明SMZ、LVFX主要通过疏水作用和氢键与HSA形成复合物；在[(HSA-LVFX)-SMZ]体系中，SMZ分子与Trp214、Val293和Pro447残基发生疏水作用，且SMZ与Asn295和Glu450残基形成3个氢键。对于[(HSA-SMZ)-LVFX]体系，LVFX被观察到与Arg218、Arg222残基形成4个氢键，且与Phe156、Phe157、Ala191、Trp214和Ala291残基发生疏水作用。分子模拟预测的药物分子结合HSA的主要作用力与热力学分析结果一致。在LVFX的存在下，SMZ与HSA的结合能由-6.04 kcal·mol-1升高到-5.32 kcal·mol-1，表明LVFX参与导致SMZ与HSA的结合能力降低。同样，在SMZ的存在下，LVFX与HSA的结合能也有所增大，从-6.33 kcal·mol-1增大到-5.95 kcal·mol-1，表明SMZ抑制了LVFX与HSA的结合。

图5 SMZ和LVFX与HSA作用的分子对接模型Fig.5 The lowest energy structure obtained from docking study of SMZ or/and LVFX with HSA(A)HSA-SMZ,(B)HSA-LVFX,(C)[(HSA-LVFX)-SMZ] and (D)[(HSA-SMZ)-LVFX]; The atoms of SMZ were color-coded as follows:C,bottle green;H,white;O,red;N,blue;S,yellow.The atoms of LVFX were color-coded as follows:C,magenta;H,white;O,red;N,blue;F,green.The blue dashed lines stand for hydrogen bonds.

3 结论

SMZ和LVFX均主要通过氢键和疏水作用与HSA发生相互作用形成基态复合物，导致HSA的内源荧光发生静态猝灭，两种药物在HSA上有一个相同的结合位点，位于HSA的Site I位。LVFX与HSA的结合能力大于SMZ，二者共存时与HSA的结合常数小于其单独与HSA的结合常数，SMZ与LVFX共存，削弱了彼此与HSA的结合能力，因而提高了血液中LVFX(或SMZ)的游离浓度，协同增强了药效。