表面增强拉曼光谱法同时检测奶粉中三聚氰胺和二聚氰胺
2017-10-19雷皓宇陈小曼李攻科胡玉玲
雷皓宇， 陈小曼， 李攻科， 胡玉玲
(中山大学化学学院，广东广州 510257)
近年国内食品安全问题层出不穷，尤其是奶粉中氰胺类物质的非法添加，严重威胁着消费者的身体健康。随着三鹿奶粉中非法添加三聚氰胺事件的曝光，部分乳制品厂商将非法添加物由三聚氰胺改用二聚氰胺。无论是三聚氰胺或二聚氰胺，人体若长期摄入均会造成累积性毒害。因此快速、高效、准确、适合于批量筛查三聚氰胺和二聚氰胺的分析检测技术的研发，对于行业监管及社会稳定具有重要的意义。目前，用于分析三聚氰胺及二聚氰胺的检测方法主要有液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[1 - 3]、高效液相色谱法(HPLC)[4 - 6]等。但上述两种方法的样品前处理步骤繁琐、耗时长，不利于现场快速检测以及实际样品的批量筛查。
表面增强拉曼散射效应是当入射光照射于粗糙贵金属时，入射光子、基质和分子三者间相互作用形成的大幅增强待测分子拉曼信号的类共振增强效应。表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是基于表面增强拉曼散射效应而发展起来的新型光谱分析手段，具有样品前处理简单、分析速度快、检测成本低等特点，可用于现场实时快速检测，已在环境监测[7 - 8]、生物检测[9 - 10]、食品检验[11 - 12]等领域得到广泛应用。在乳制品检测领域，现有SERS方法无法对三聚氰胺及二聚氰胺进行同时检测。Yang等[13]建立了奶粉中三聚氰胺分析的SERS法，该法检出限高于国家限量值1 mg/kg；Lin等[14]建立了奶粉中二聚氰胺分析的SERS法，该法线性范围为100～1 000 mg/L，灵敏度欠佳。本文使用15%三氯乙酸溶液提取奶粉样品中三聚氰胺及二聚氰胺，并通过中性氧化铝吸附杂质，实现了对奶粉中三聚氰胺和二聚氰胺两种氰胺类物质的同时检测，降低了杂质对检测的影响，提高了检测的灵敏度。该方法可用于对奶粉中非法添加氰胺类物质的检测，对奶粉质量起到一定的监控作用。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Delta Nu Inspector便携式拉曼光谱仪(美国，Delta Nu)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MIULAB微型离心机(杭州米欧仪器有限公司)。
三聚氰胺(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；三氯乙酸(分析纯，广州化学试剂厂)；乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃(分析纯，广州化学试剂厂)；活性碳粉(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；硅胶(分析纯，烟台黄务硅胶开发试验厂)；硅藻土(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；中性氧化铝(分析纯，上海五四化学试剂有限公司)；SERS增强试剂CP-1(厦门市普识纳米科技有限公司)。实验用水为超纯水。
三聚氰胺标准奶粉(含量16.2 mg/kg，广州市质量技术监督局)；其他奶粉样品(广州市海珠区某商场)。
1.2 实验方法
1.2.1标准溶液的配制三聚氰胺标准溶液的配制：用超纯水配制浓度为500 mg/L的三聚氰胺标准储备液，并用15%三氯乙酸溶液将储备液逐级稀释，得到0.0050、0.010、0.025、0.050、0.075 mg/L的系列浓度标准溶液。二聚氰胺标准溶液的配制：用超纯水配制浓度为500 mg/L的二聚氰胺标准储备液，并用15%三氯乙酸溶液将储备液逐级稀释，得到0.50、1.0、2.5、5.0、7.5、10 mg/L的系列浓度标准溶液。
1.2.2奶粉样品前处理取奶粉样品0.04 g，加入2 mL 15%三氯乙酸溶液，在300 W下超声提取5 min，9 000 r/min下离心5 min。上清液转移至含有0.02 g中性氧化铝的离心管中，超声、离心各3 min，静置待测。
1.2.3SERS检测移取300 μL SERS增强试剂CP-1于拉曼管中，加入50 μL待测液，混匀后进行SERS检测。由三聚氰胺或二聚氰胺各自特征峰定性，根据峰面积采用外标法定量。拉曼光谱激发波长：785 nm；激光功率：45 mW。
2 结果与讨论
2.1 三聚氰胺和二聚氰胺特征峰的判定
以15%三氯乙酸溶液为溶剂，分别配制2 mg/L三聚氰胺标准溶液、4 mg/L二聚氰胺标准溶液、2 mg/L 三聚氰胺和 4 mg/L二聚氰胺混合标准溶液进行SERS检测，实验结果如图1所示。与红外光谱对照可知，三聚氰胺溶液在716 cm-1处特征峰可能是由于原678～688 cm-1三嗪环内伸缩振动峰[15]在纳米金表面的强极化作用下发生位移，使谱峰向高波数移动近40 cm-1[16]而形成，在1 219 cm-1处特征峰可能为C-N键伸缩振动峰。二聚氰胺溶液在667 cm-1处有明显拉曼响应，可能是N-H的面外弯曲振动峰。当待测液中667 cm-1、716 cm-1、1 219 cm-1处特征峰同时存在时，则表明奶粉中三聚氰胺及二聚氰胺同时存在，从而实现奶粉中三聚氰胺及二聚氰胺的快速筛查。
2.2 样品前处理条件的优化
2.2.1提取溶剂的选择实验考察了1%三氯乙酸溶液、四氢呋喃、乙醇、甲醇、乙腈、15%三氯乙酸溶液分别作为提取溶剂时，对奶粉加标1.00 mg/kg三聚氰胺及100 mg/kg二聚氰胺提取效果的影响。体系中提取剂的作用主要为：(1)提取奶粉中三聚氰胺及二聚氰胺；(2)沉淀奶粉中的蛋白质；(3)使SERS增强试剂团聚以增强SERS信号。如图2所示，实验结果表明只有15%三氯乙酸溶液同时满足上述三点要求，因而最终选择15%三氯乙酸溶液作为提取溶剂。
2.2.2杂质吸附剂的选择实验分别考察了中性氧化铝、硅胶、硅藻土、活性碳作为杂质吸附剂时，对奶粉中杂质吸附的效果，结果如表1所示。奶粉加标100 mg/kg二聚氰胺或加标1.00 mg/kg三聚氰胺后，添加中性氧化铝作为吸附剂时加标回收率最高，因此选择中性氧化铝作为杂质吸附剂。
2.3 基质干扰实验
实验考察了奶粉中不同基质对0.05 mg/L三聚氰胺或2 mg/L二聚氰胺分析造成的干扰。由于奶粉中大多数蛋白质、脂肪、脂溶性维生素均不溶于15%三氯乙酸溶液溶液，因此实验主要考察水溶性维生素、肌醇及金属离子对检测的影响，结果见表2。
图1 二聚氰胺、三聚氰胺混合标准溶液及加标奶粉样品的表面增强拉曼光谱(SERS)图谱Fig.1 SERS spectra of dicyandiamide,melamine mixed standard solution and spiked milk powder a-e：SERS spectra of blank solution,2.5 mg/L dicyandiamide standard solution,0.020 mg/L melamine standard solution,2.5 mg/L dicyandiamide and 0.020 mg/L melamine mixed standard solution,milk powder spiked with 100 mg/kg dicyandiamide and 1.00 mg/kg melamine,respectively.
图2 使用不同提取剂时加标奶粉中三聚氰胺及二聚氰胺的表面增强拉曼光谱(SERS)图谱Fig.2 SERS spectra of melamine and dicyandiamide in spiked milk powder extracted by different agentsa-f:Extracting agent of 1% trichloroacetic acid,tetrahydrofuran,ethanol,methanol,acetonitrile and 15%trichloroacetic acid,respectively.
AdsorbentMelamineDicyandiamideRecovery(%)RSD(%,n=5)Recovery(%)RSD(%,n=5)Neutral alumina90.38.597.12.8Silica gel73.06.488.57.7Diatomite82.13.362.94.0Activated carbon0-49.22.5
表2 三聚氰胺、二聚氰胺基质干扰实验结果
2.4 三聚氰胺、二聚氰胺的标准工作曲线
在优化条件下，以716 cm-1处拉曼峰面积对应标准溶液浓度绘制三聚氰胺的标准曲线，实验结果如图3所示：三聚氰胺在0.0050～0.075 mg/L浓度范围内，线性相关系数r2=0.9988，方法检出限(LOD，S/N=3)为0.0015 mg/L，定量限(LOQ，S/N=10)为0.0050 mg/L。以667 cm-1处特征峰峰面积对应标准溶液浓度绘制二聚氰胺的标准曲线，结果如图4所示：二聚氰胺在0.50～10 mg/L浓度范围内，线性相关系数r2=0.9966，LOD(S/N=3)为0.15 mg/L，LOQ(S/N=10)为0.50 mg/L。
图3 三聚氰胺标准溶液的表面增强拉曼光谱(SERS)图谱Fig.3 SERS spectra of melamine standard solutiona-f.SERS spectra of 0,0.0050,0.010,0.025,0.050 and 0.075 mg/L melamine,respectively.
图4 二聚氰胺标准溶液的表面增强拉曼光谱(SERS)图谱Fig.4 SERS spectra of dicyandiamide standard solutiona-g.SERS spectra of 0,0.50,1.0,2.5,5.0,7.5 and 10 mg/L dicyandiamide,respectively.
2.5 奶粉中三聚氰胺、二聚氰胺的分析
选取16.2 mg/kg三聚氰胺标准奶粉进行SERS分析，SERS法检测值为17.3 mg/kg，RSD为6.7%，SERS法测定值与标准值的比值为1.08，实验结果如图5、图6所示。从商场中随机抽取婴儿、学生、女士、中老年4种奶粉，未检测到三聚氰胺和二聚氰胺，分别添加三聚氰胺、二聚氰胺进行加标回收率实验。结果见表3，三聚氰胺的回收率在79.5%～124%间，RSD小于8.8%(n=5)；二聚氰胺的回收率在76.5%～112%间，RSD小于9.4%(n=5)，表明该方法准确可靠。
实验中回收率的偏差主要来源于所测奶粉中所含杂质种类及含量，由于奶粉中存有少量不被中性氧化铝吸附除去的杂质，因此该类杂质的含量将会影响到回收率大小，从而造成偏差。
图5 奶粉中三聚氰胺检测的拉曼图谱Fig.5 SERS spectra of melamine detection in milk powdera-c:blank solution,melamine standard milk powder and 0.0075 mg/L melamine standard solution,respectively.
图6 奶粉中二聚氰胺检测的拉曼图谱Fig.6 SERS spectra of dicyandiamide detection in milk powdera-c:blank solution,milk powder spiked with 40 mg/kg dicyandiamide and 2.5 mg/L dicyandiamide standard solution,respectively.
ClassificationMelamineDicyandiamideAdded(mg/kg)Found(mg/kg)Recovery(%)RSD(%,n=5)Added(mg/kg)Found(mg/kg)Recovery(%)RSD(%,n=5)Milk powder 0.50.42785.48.840.035.087.48.2for student1.00.79579.55.680.061.576.96.42.01.9798.56.11201341125.9Milk powder for 0.50.621246.540.041.21037.5middle-aged 1.01.021027.580.078.698.26.4and old people2.01.9698.11.21201251047.8Milk powder0.50.43186.22.340.033.383.33.6 for women1.00.99599.54.280.061.276.57.72.02.201104.412010889.69.4Milk powder0.50.621246.540.035.087.57.3 for infant1.01.021027.580.079.399.16.92.01.9698.11.212010688.42.1
3 结论
本文建立了奶粉中三聚氰胺与二聚氰胺同时检测的表面增强拉曼光谱分析法。方法三聚氰胺线性范围为0.0050～0.075 mg/L，检出限为0.0015 mg/L，回收率在79.5%～124%之间，RSD小于8.8%(n=5)，使用标准奶粉进行SERS分析的检测值与标准值比值为1.08。方法二聚氰胺线性范围为0.50～10 mg/L，检出限为0.15 mg/L，回收率在76.5%～112%之间，RSD小于9.4%(n=5)。实验结果表明，该方法前处理效果良好，相对常规色谱方法，可大大减少实验耗时、简化实验过程并降低实验成本。快速检测奶粉中的三聚氰胺及二聚氰胺，在奶粉质量监控方面具有良好的应用潜力。
