气相色谱-质谱法分析乳腺癌患者血清中的代谢物

李 斌， 黄玲玲， 徐小梅， 万益群*，2

(1.南昌大学化学学院，江西南昌 330031；2.南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047)

代谢组学是监测生物体在病理生理状态下内源性代谢产物动态变化规律的学科，常用于疾病的早期诊断、治疗以及术后评估[1 - 3]，在疾病研究中受到广泛的关注。代谢组学在恶性肿瘤研究中也显示其独特的优势[4 - 6]，特别是在肿瘤的早期诊断、病理分析以及预后评估方面发挥着重要的作用。目前，代谢组学研究技术主要有核磁共振波谱(NMR)、毛细管电泳-质谱法(CE-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法(LC-MS)[7 - 8]。其中，气相色谱-质谱法由于具有较高的灵敏度、分离度以及较完整的质谱库而被广泛应用于代谢组学研究当中。同时，用于代谢组学研究的数据处理方法也有多种[9]，包括主成分分析法(PCA)、偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)、层级聚类分析(HCA)、神经网络(NN)和遗传算法(GA)等[10 - 12]。

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，发病机理尚不清楚，环境的诱导和遗传物质的变异可能为其重要的致病因素。目前，临床上乳腺癌诊断的主要方法包括X线射影、超声扫描、MRI扫描、CT扫描的影像方法，以及借影像定位穿刺活检明确诊断的方法。这些方法对中晚期乳腺癌的诊断有较好的准确性，而对早期乳腺癌的诊断缺乏特异性和灵敏度。由于乳腺肿瘤标志物可以反映肿瘤的生物学特性，对于临床诊断和治疗有较好的辅助作用，并对乳腺肿瘤的预后判断具有重要的意义，所以肿瘤标志物的筛选也越来越受到研究者的重视。采用代谢组学方法筛查用于乳腺癌早期诊断的特异性标志物，并开发快速、无创伤的乳腺癌早期诊断新技术，具有重要的应用价值[13 - 14]。本文以乳腺癌患者、一般疾病者和健康人血清为研究对象，采用气相色谱-质谱分析技术，构建了其血清代谢指纹图谱，并采用化学计量学方法对实验数据进行了聚类分析，对乳腺癌标志物的筛查进行了初步的有益探索。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6890N/5973I气相色谱-质谱仪(美国，安捷伦公司)，包括Agilent 7683自动进样器和气相色谱-质谱工作站(D.01.02)；KQ-100DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AP250D型电子天平(奥豪斯国际贸易(上海)有限公司)；TDL-5-A型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；MS2型迷你振荡器(广州仪科实验室技术有限公司)。

N,O -双甲氧基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)、甲氧胺盐酸盐(美国Sigma公司)；异亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、半胱氨酸、甘氨酸、色氨酸、谷氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸盐、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、4-羟基脯氨酸、精氨酸标准品(美国Sigma公司)；半乳糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸标准品(美国Sigma公司)；甲醇、乙腈、丙酮(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；正二十二烷、吡啶、正庚烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。实验用水由Milli-QS超纯水装置(美国，Millipore公司)制备。

1.2 气相色谱分析条件

色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：270 ℃；升温程序：85 ℃保持5 min，以10 ℃/min升至300 ℃保持10 min；载气：高纯氦气，流速为1.0 mL/min；进样量2.0 μL(不分流进样)；溶剂延迟5 min。

1.3 质谱条件

GC-MS接口温度：280 ℃；电离方式：EI，电离能量70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子倍增器电压：1 753 V；采集方式：全扫描(m/z)60～600。

1.4 样品采集及前处理

经组织学或细胞学证实的乳腺癌患者30例；乳腺检查无异常、无乳腺癌发病史的健康对照组32例；一般疾病者30例，三组样本在年龄、性别方面都较匹配。采集各类人群(其中乳腺癌血清样本为患者入院后未进行任何治疗)晨起静脉血4 mL，4 000 r/min离心20 min，取上清液，-80 ℃保存备用。取200 μL血清于1 mL的塑料离心管中，加入800 μL甲醇、乙腈和丙酮的混合溶液(甲醇∶乙腈∶丙酮=1∶1∶1(V/V))，涡旋1 min，冰浴超声10 min，10 000 r/min 离心10 min。吸取上清液800 μL于进样瓶，氮气吹干后，加入75 μL甲氧胺吡啶溶液，70 ℃反应1 h后，冷却至室温。再加入BSTFA+1%TMCS溶液75 μL，室温反应1 h，加入150 μL终止溶剂正庚烷(含0.1 g/L二十二烷)，以二十二烷为代谢物定量的内标物质，待测定。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择

人体血清成分主要以氨基酸、糖类和脂肪酸三类代谢物为主。为获得血清中更多的代谢信息，实验分别考察了甲醇、乙腈、丙酮对血清中内源性物质的提取效果。结果表明，甲醇和乙腈可沉淀蛋白，对血清中的氨基酸类物质提取效果较好，而丙酮对血清中糖类和脂肪酸类物质提取效果较好，但蛋白质沉淀能力不强。综合考虑，本实验选用甲醇∶乙腈∶丙酮=1∶1∶1(V/V/V)作为血清内源性物质的提取剂和蛋白质沉淀剂。采用BSTFA+1%TMCS溶液对提取液进行衍生化，并在优化的分析条件下进行测定[15 - 18]。

图1 乳腺癌血清样本分析的色谱图Fig.1 Chromatogram of serum samples from breast cancer

2.2 色谱分离条件的选择

为了使血清中的内源性代谢产物实现良好的分离，实验分别考察了下列四种升温程序下组分的分离情况：(1) 85 ℃保持5 min，10 ℃/min升至300 ℃保持10 min；(2) 85 ℃保持5 min，以8 ℃/min升至205 ℃保持5 min，再以8 ℃/min升至300 ℃保持5 min；(3) 100 ℃保持3 min，以8 ℃/min升至300 ℃保持2 min；(4) 70 ℃保持5 min，以20 ℃/min升至160 ℃保持4 min，10 ℃/min升至300 ℃保持1.5 min。综合考虑代谢物质的分离效果和色谱峰个数，选择第一种升温程序作为实验条件，实际血清样品的色谱分离图见图1。

2.3 血清样本分析

将采集到的血清样本92例,其中健康人32例，一般疾病者30例，乳腺癌患者30例，按优化的样品前处理方法和气相色谱-质谱条件进行分析，共得到了30个共有峰。为了对血清中复杂的代谢物进行定性，我们将其分为氨基酸、糖类和脂肪酸代谢产物三大类，其中脂肪酸类物质的衍生物在NIST数据库中信息丰富，且其匹配度>95%，可以直接从谱库中定性；而氨基酸和糖类物质经过衍生化后在质谱数据库中匹配率较低，因此此两类物质采用标准品进行定性，实验以二十二烷为内标，定量结果以代谢物峰面积(Ax)与内标物峰面积(Ai)比值的形式表示，表1列出了30个共有峰的定性及定量结果。

表1 血清样品中30个色谱共有峰的定性及定量结果

2.4 实验数据分析

分别采用主成分分析(PCA)和随机森林算法(RF)对三组样本的氨基酸、糖类和脂肪酸代谢产物的分布、分类情况进行分析。采用PCA对三类数据进行分析，得到的分析结果如图2所示。从图中可以看出健康人和一般疾病者的样本点距离比较近，且存在部分重叠，而乳腺癌患者样本点距离健康人和一般疾病者较远，表明乳腺癌对人体的代谢有较大影响。PCA分析能够初步地体现样本间的差异，进一步采用随机森林(RF)算法对这三类数据进行分析，见图3。图3表明，和PCA分析结果相比，随机森林算法能够更加有效地区分不同组群样本间的差异，并在训练的过程中能够得到各代谢物的变量重要度信息，而其中对分类起着重要作用的变量可能是潜在的生物标志物。

从图3可见，使用随机森林算法得到的分类模型，不同组间的差异被更加明显地反映出来，图4中列出了各代谢产物的变量重要度。在乳腺癌样品和非乳腺癌组样品中具有显著性差异的物质主要有磷酸、2,4-二羟基丁酸、N-巴豆酰基甘氨酸、N-1-己酰甘氨酸、N-苯基甘氨酸和棕榈酸。蛋白质的磷酸化过程是生物体代谢的重要调节过程，对正常的生物化学反应有重要的指示作用，通过磷酸化和去磷酸过程细胞进行正常的物质代谢，磷酸含量出现显著性差异说明乳腺癌可能导致蛋白质的磷酸化过程发生异常。三种甘氨酸类似物表现出明显的差异，说明甘氨酸的代谢途径可能在乳腺癌患者中发生了改变，使其次级代谢途径中的三种代谢物发生了变化。2,4-二羟基丁酸和棕榈酸都属于脂肪酸家族代谢物质，脂质代谢与乳腺癌的发生发展的联系早有报道，Lv等[19]采用气相色谱-质谱结合多元统计法分析了乳腺癌患者游离脂肪酸的代谢谱，通过游离脂肪酸代谢组学分析，将健康对照组和乳腺癌组完全分开，得到几种差异明显的代谢物，主要有棕榈酸，亚油酸，硬脂酸等，有可能作为乳腺癌早期诊断的标志物。本研究结果也说明了脂肪酸的代谢与乳腺癌的发生有一定的联系，与文献报道结果相符。

图2 三类样本的主成分分析(PCA)结果Fig.2 Analytical results of three group of samples with PCA

图3 三类样本的随机森林算法(RF)分析结果Fig.3 Analytical results of three group samples with RF

图4 各代谢产物的变量重要度Fig.4 The variable importance of metabolites

3 结论

本文采用气相色谱-质谱分析技术对乳腺癌患者血清中的代谢物进行了系统研究，通过主成分分析和随机森林算法对健康组、一般疾病者组和乳腺癌患者组进行了分类，筛选出具有显著性差异的六种物质：磷酸、2,4-二羟基丁酸、N-巴豆酰基甘氨酸、N-1-己酰甘氨酸、N-苯基甘氨酸和棕榈酸。此六种物质出现明显差异，说明乳腺癌疾病导致脂质和氨基酸代谢发生了异常。