北冬虫夏草虫草素提取工艺研究

张凤清 赵 丽 刘美善 崔林虎 滕 月 玄永男*

（1长春工业大学，吉林长春130014；2延边林业科学研究院，吉林延吉133001）

北冬虫夏草（Cordyceps militaris），别名蛹虫草、北虫草，隶属于子囊菌亚门，麦角菌科、虫草属[1]，是虫草属的模式种。野生的北冬虫夏草与冬虫夏草具有相似的生物活性成分，主要包括虫草素、虫草酸、虫草多糖、麦角甾醇、氨基酸、核苷类物质等，功效与冬虫夏草相似[2-4]。

冬虫夏草菌和北冬虫夏草菌发挥药理作用的物质基础是产生多种生物活性物质，其中，最著名的就是蛹虫草菌产生的虫草素[5]，虫草素具有抗菌、抗肿瘤、增强免疫力等多种生物功效，已引起国内外专家的极大关注。目前，已有不少以虫草素为主的药品、保健品及化妆品研发成果，如虫草素胶囊、用于治疗动脉粥样硬化及抗抑郁的药物等。而我国由虫草素合成的治疗白血病新药也已进入Ⅰ期临床阶段[6]。试验选择桑蚕蛹为培养基质栽培得到的北冬虫夏草进行虫草素提取工艺的研究，以期为进一步进行虫草素工业化提取提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验试剂、设备虫草素标准品，（纯度＞98%）上海融禾医药科技有限公司。高效液相色谱：Agilent 1200 infinity Series美国Sigma公司。超高压设备：HPP600 MPa/30 L，包头科发高压科技有限责任公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液制备 精确称取干燥至质量恒定虫草素标准品4 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容作为标准储备液，质量浓度为80 μg/mL。用超纯水分别稀释成2、5、10、20、40、80 μg/mL的虫草素标准溶液。

1.2.2 样品前处理 将虫草原料置于40℃烘干箱中烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至质量恒定的样品0.50 g于50 mL离心管中，加入25 mL提取液后超声提取，提取结束后将离心管置于20℃、5000 r/min的离心机中离心10 min，吸取上清液1 mL，经0.45 μm水相微孔滤膜过滤后直接注入进样瓶以供分析。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，51 μm）；流动相：以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（取三氟乙酸600 μL加水配制成600 mL，（2∶98），流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，进样方式为自动进样；柱温为30℃，检测波长为260 nm。

1.2.4 虫草素标准曲线的绘制 取6个不同质量浓度的标准溶液涡旋振荡充分混匀，用0.45 μm水相微孔滤膜过滤后直接注入进样瓶。每个进样重复3次，以虫草素的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，虫草素均在2～801 μg/mL范围内，质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系，虫草素的回归方程为y=38505x+8952.2，r=0.9993。

1.2.5 提取方法优选

1.2.5.1 水热回流法 精密称取粉碎过60目筛的北冬虫夏草10 g。置于80℃水浴锅中提取3次，加水量分别为样品重的10、8.8倍，提取时间为每次2 h，合并提取液过滤，收集滤液并定容至250 mL。

1.2.5.2 醇热回流法 精密称取粉碎过60目筛的北冬虫夏草10 g，置于80℃水浴锅中提取三次，加入75%乙醇量分别为样品重的10、8.8倍，提取时间为每次2 h，合并提取液过滤，收集滤液并定容至250 mL。

1.2.5.3 超高压萃取 精密称取粉碎过60目筛的北冬虫夏草10 g，准确加入250 mL 50%乙醇，密封混匀，300 MPa，5 min。

1.2.6 提取工艺条件优选

1.2.6.1 单因素试验 溶剂体积分数：分别准确加入10%，30%，50%，70%，90%体积分数的乙醇500 mL；

固液比：精确称定10 g样品5份，以10、25、50、75、100倍分别加入70%乙醇。

压力的选择：精确称定10 g样品5份，分别加入70%乙醇1000 mL。密封混匀，加压100、200、300、400、500、600 MPa。

1.2.6.2 正交试验设计 在单因素试验的基础上，按照尽量减少试验次数和寻求设计最优的原则，选择提取压力（A）、容积体积分数（B）和固液比（C）作为因素，每个因素各取3个水平，正交试验方案见2.2.4。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取虫草素情况比较由表1结果可知超高压萃取法的提取率远高于其他两种方法，故选择超高压萃取法为提取方法。

表1 不同提取方法对虫草素提取率的影响

2.2 提取工艺条件优选

2.2.1 溶剂体积分数的选择 随着乙醇的体积分数逐渐增大，虫草素随之升高，而乙醇体积分数达到90%时，虫草素的提取率明显降低，因此选择乙醇的最佳体积分数为30%～70%。

表2 超高压萃取提取虫草素的乙醇体积分数

2.2.2 固液比的选择 由表3可以看出随着固液比的增加虫草素的提取率逐渐增加。但考虑到有效成分提取分离的后处理的工作量以及经济性，选择最佳固液比范围为1∶25～1∶75。

2.2.3 压力的选择 由表4可见随着提取压力的提高，提取率逐渐升高，在100～500 MPa时，两者呈线性正相关关系，当压力达到600 MPa时，提取率有所降低，由此可得最佳压力为100～500 MPa。

2.2.4 正交试验设计方案及结果 结果表明，各因素对虫草素提取率影响大小为A=C＞B，最佳试验方案为A3B2C3，即提取压力500 MPa、容积体积分数为50%，固液比1∶75、提取时间为2 min，追加试验结果

表3 超高压提取虫草素的不同固液比

表4 超高压提取虫草素的不同压力收率比较

表5 L9（34）正交试验设计方案及结果

3 小结与讨论

最佳提取工艺条件为使用超高压提取方法，提取压力500 MPa、容积体积分数为50%，固液比1∶75、提取时间为2 min，提取率达到5.5 mg/g。

超高压技术在我国还处于起步阶段，该技术在国内外主要应用于食品业，目的是为了防止食物的微生物污染、延长食品储藏时间[7]。2004年吉林工业大学张守勤等[8]率先将该技术应用于中药提取，随后，在黄酮类[9，10]皂苷类[11，12]多糖类[13，14]等的提取中均得到了应用，结果表明其在有效成分提取方面具有许多独特的优势。超高压提取在常温下进行，该条件有助于对温度敏感的成分的活性保持，适用范围广，提取时间短，一般只需1～20 min；提取效率高，提取产物杂质含量少，能够明显减少原料中的微生物含量，从而延长存放时间；提取过程中无溶剂的挥发，不会对环境造成污染，而且提取工艺简单，机械化程度高，适宜由实验室推广到现代化大生产中[13]。

试验以桑蚕蛹北冬虫夏草为试验对象，选用超高压提取方法对虫草素进行提取，全程只需要加压的阶段消耗电能，一次可以处理几十千克物料，提取时间短，提取率高，是适合虫草素工业化提取的绿色环保节能的提取工艺。