脐带间充质干细胞治疗糖尿病肾病大鼠的效果观察

尤冠巧 张丽娜 陶琳 刘冰

(河南省人民医院 肾内科 河南 郑州 450003)

·论著·

脐带间充质干细胞治疗糖尿病肾病大鼠的效果观察

尤冠巧 张丽娜 陶琳 刘冰

(河南省人民医院 肾内科 河南 郑州 450003)

目的观察脐带间充质干细胞(UC-MSCs)经体外扩增培养后移植入糖尿病肾病大鼠体内对糖尿病肾病的疗效。方法将雄性SD大鼠50只随机选择10只为正常对照组，成功制备糖尿病肾病大鼠32只，随机分为糖尿病肾病组和干细胞移植组。MSCs经体外培养、鉴定、BrdU标记后，将UC-MSCs细胞总数量2×106个通过尾静脉移植入干细胞移植组大鼠体内，正常对照组、糖尿病肾病组大鼠注射等量无血清的L-DMEM培养基。7 d后再用同样的方法注射第2次。于末次注射后7、14、21 d测定大鼠血糖、体质量、24 h尿蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数，观察大鼠肾脏病理变化和标记干细胞存活情况。结果在各观察时点，与正常对照组相比，干细胞移植组和糖尿病肾病组血糖、尿蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数均高于正常对照组(P<0.05)，体质量均低于正常对照组(P<0.05)。在干细胞移植后7 d，与糖尿病肾病组相比，干细胞移植组大鼠血糖降低，差异有统计学意义(P<0.05)，体质量、24 h尿蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数组间差异无统计学意义(P>0.05)。在干细胞移植后14、21 d，与糖尿病肾病组相比，干细胞移植组大鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐清除率降低，差异有统计学意义(P<0.05)，体质量稍有升高，差异无统计学意义(P>0.05)，肾脏肥大指数降低，差异无统计学意义(P>0.05)。在干细胞移植后21 d，在肾脏组织中可见少量BrdU标记的阳性细胞，糖尿病肾病组肾小球肥大、基底膜增厚，干细胞移植组较糖尿病肾病组有所改善。结论UC-MSCs经体外培养标记后移植入糖尿病肾病大鼠体内，能趋化到糖尿病肾病大鼠的肾脏，且可以一定程度上改善糖尿病肾病。

脐带间充质干细胞；糖尿病肾病；干细胞移植

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的慢性并发症之一，其预防和治疗缺乏行之有效的措施。间充质干细胞(MSCs)是一类具有自我更新、多向分化潜能、免疫调节和低免疫原性的细胞。目前有少数动物实验证实骨髓源MSCs治疗糖尿病肾病有效，但脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对糖尿病肾病大鼠肾脏的作用如何尚不可知。UC-MSCs来源丰富，脐带中免疫系统处于原始状态，移植后急、慢性移植物抗宿主反应发生率较低，严重程度轻，故本研究选用人脐带制备MSCs治疗糖尿病肾病大鼠。

本研究以链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠为研究对象，以UC-MSCs输注为干预措施，收集大鼠体质量、24 h尿蛋白定量、血糖、肌酐清除率、标记干细胞体内分布情况、肾脏病理等变化情况资料，观察UC-MSCs对糖尿病肾病大鼠的治疗效果，为UC-MSCs应用于糖尿病肾病提供实证数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1试剂STZ购自Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，L-DMEM培养基购自Gibco公司，BrdU标记及检测试剂盒购自Roche kit Ⅱ。

1.2UC-MSCs的分离培养和鉴定取足月妊娠剖宫产的新生儿脐带，利用酶消化法和贴壁法获得原代细胞，传4～6代后备用。消化生长状态良好的细胞，接种一定数量(约2×106细胞/孔)的细胞于petri皿中，每2 d更换1次培养基，分阶段诱导14 d后获得MSCs。诱导体系如下。预分化：L-DMEM+1% 13-巯基乙醇，诱导2 d；第2阶段：L-DMEM+100 ng/ml EGF+10 ng/ml bFGF+2%B27，诱导6 d；第3阶段：L-DMEM+20 mmol/L尼克酰胺，诱导6 d；对照组培养体系：F12+10%FBS+10 ng/ml bFGF。通过流式细胞仪表面标志鉴定CD34、CD45呈阴性，CD44、CD71、CD105呈阳性，符合MSCs的生长特性。

1.32型糖尿病肾病大鼠模型的建立清洁级雄性SD大鼠，体质量180～200 g。大鼠适应性饲养1周后，2型糖尿病大鼠模型采用RATNA SDANDA提供的方法并适当修改。将实验动物随机分为正常对照组(10只)、实验组(40只)。实验期间饮水充足，保证正常光照条件。

正常对照组采用普通饮食。糖尿病肾病组采用高糖高脂饮食配方为常规饲料(蛋白质31.10%，脂肪7.79%，其他61.11%)加20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇制成。用高糖高脂饲料喂养大鼠4周后，以60 mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ(溶解于新鲜配制的0.1 mol/L柠椽酸缓冲液中，pH值为4.2，浓度0.25%)。3 d后测非禁食血糖，血糖≥16.7 mmol/L为2型糖尿病大鼠模型成模。糖尿病成模后4周，若大鼠尿量>原尿量150%，尿蛋白>30 mg/24 h尿，则糖尿病肾病成模。正常对照组腹腔注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.4MSCs的移植用BrdU标记已制备的UC-MSCs。将实验组造模成功的糖尿病肾病大鼠(32只)按随机原则分为糖尿病肾病组(16只)和干细胞移植组(16只)。将糖尿病肾病大鼠，用亚致死剂量放射线(300 cGy)照射，照射24 h后，将UC-MSCs细胞总数量2×106通过尾静脉移植入干细胞移植组大鼠体内，正常对照组、糖尿病肾病组大鼠注射等量无血清的L-DMEM培养基。7 d后再用同样的方法注射第2次。

1.5移植后疗效的检测分别于MSCs末次移植后7、14、21 d处死大鼠，取大鼠尾静脉血检测血糖，同时用大鼠代谢笼留取大鼠24 h尿液，检测大鼠24 h尿蛋白。尿标本采用大鼠金属代谢笼收集，大鼠在代谢笼中自由饮食饮水，收集24 h尿量，离心后置于-20 ℃冰箱保存待测。①生化指标测定：血糖检测采用罗氏罗康全活力型血糖仪；24 h尿蛋白测定采用Olympus AU6000全自动生化分析仪测定；血、尿肌酐测定采用苦味酸法，计算肌酐清除率(ml/min)。②肾脏肥大指数计算：大鼠处死前称体质量(BW)，处死大鼠后取双侧肾脏，分别称肾重(KW)，计算肾脏肥大指数=[KW(g)/BW(g)]×103。③肾脏组织病理方法检测是否有移植MSCs存在：取大鼠右肾组织，冷盐水冲洗，40 g/L多聚甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，制成5 μm石腊切片，分别行HE染色，BrdU免疫组化检测干细胞在移植大鼠体内分布情况，按照试剂盒要求加入一抗、二抗及镜下显色，甘油明胶封片，核呈棕黄色为阳性反应。

2 结果

2.1干细胞移植后疗效监测在各观察时点，与正常对照组相比，干细胞移植组和糖尿病肾病组血糖、尿蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数均高于正常对照组(P<0.05)，体质量均低于正常对照组(P<0.05)。在干细胞移植后7 d，与糖尿病肾病组相比，干细胞移植组大鼠血糖降低，差异有统计学意义(P<0.05)，体质量、24 h尿蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数组间差异无统计学意义(P>0.05)。在干细胞移植后14、21 d，与糖尿病肾病组相比，干细胞移植组大鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐清除率降低，差异有统计学意义(P<0.05)，体质量稍有升高，差异无统计学意义(P>0.05)，肾脏肥大指数降低，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2肾脏病理结果正常对照组肾小球未见系膜区基质增多及系膜细胞增生，基底膜未见增厚。见图1。糖尿病肾病组肾小球发生肥大、呈结节状硬化、基底膜弥漫增厚、系膜区基质明显增多。见图2。干细胞移植组仍可见肾小球体积肥大、基底膜增厚、系膜区基质增多，但较糖尿病肾病组略有改善。见图3。干细胞移植后3周肾小球内可找到BrdU阳性细胞，主要位于肾间质。见图4。

表1 干细胞移植后各组大鼠血糖、体质量、尿蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与糖尿病肾病组比较，bP<0.05。

图1 正常对照组HE图(×400)

图2 糖尿病肾病组HE图(×400)

图3 干细胞移植组HE图(×400)

图4 干细胞移植后3周BrdU免疫组化ABC(×200)

3 讨论

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在不同条件下，它可以分化成不同功能的细胞。除了胚胎干细胞因伦理等因素受到一定限制外，其他还有3类干细胞，都在进行着广泛的研究。第一是数量相对最多的存在于骨髓的造血干细胞；第二是脐带和脐血里有丰富的多种潜能干细胞；还有一少部分在外周血液中，包括少量的造血干细胞、内皮干细胞等。人脐带中含有许多未成熟的干细胞，具有广泛的增殖能力和分化潜能。人UC-MSCs不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫原性低，是一类低免疫原性细胞，不须经过严格配对使用，异体及异种移植无免疫排斥反应或反应较弱，适宜于不同个体之间的移植。有研究将人来源的脐带、脐血、骨髓MSCs输注给SD大鼠、NOD/SCID鼠等均未发生GVHD的表现[1-2]。且人脐带来源丰富，易得到孕妇及家属的同意，采集方便，对供者无痛苦、无伤害。因此，本实验选择UC-MSCs作为研究对象。

已有一些研究将人UC-MSCs用于不同肾脏病动物模型的研究。张冰等[3]研究发现，人UC-MSCs移植入缺血再灌注诱导的急性肾损伤大鼠，人UC-MSCs可向损伤的肾小管上皮迁移，对肾脏组织起到保护和促进修复作用。李芳等[4]将人UC-MSCs移植入急性肾小管坏死的家犬模型，发现人UC-MSCs移植后可在急性肾小管坏死肾脏内存活，对正常肾脏无影响；对于急性肾小管坏死家犬，人UC-MSCs选择性存在于肾脏内，对心脏、肝脏及胰腺无影响。汤杰印[5]观察了人UC-MSCs移植对阿霉素肾病的肾脏保护作用，发现人UC-MSCs移植可改善阿霉素肾病大鼠的临床及实验室检查指标，延缓阿霉素肾病的进展，其机制可能是通过内分泌或旁分泌途径发挥肾脏保护作用。

少数动物实验证实，MSCs移植可改善糖尿病肾病动物血糖、保护肾脏功能。Lee等[6]研究表明将MSCs移植给1型糖尿病肾病小鼠后1个月，在肾脏中只发现少量MSCs，提示MSCs分化为肾脏细胞可能不是主要机制。Ezquer等[7]研究表明，MSCs移植后归巢于NOD/SCID鼠胰岛组织，向胰岛素分泌细胞分化，改善胰岛功能，使血糖和尿糖含量下降，延缓了糖尿病肾病的发生发展。周虹等[8]将大鼠骨髓MSCs应用于糖尿病肾病大鼠的治疗，干细胞治疗后l周移植组较糖尿病肾病对照组血糖降低；第2、8周移植组较糖尿病肾病对照组24 h尿总蛋白降低；移植组肌酐清除率低于糖尿病肾病对照组；第2周移植组的肾脏肥大指数较糖尿病肾病对照组减少。这提示MSCs经体外培养标记后在体内能趋化到糖尿病肾病大鼠肾脏，可以暂时改善糖尿病肾病。相似研究发现，经尾静脉注射的骨髓MSCs可定位于2型糖尿病大鼠胰腺及肾脏，并对受损胰腺及肾脏有修复作用，降低血糖，减少尿蛋白排泄，降低血清胰岛素水平，提高血清脂联素含量，改善胰岛素抵抗[9]。

人UC-MSCs移植对2型糖尿病肾病大鼠的作用如何呢？本研究发现，在干细胞移植后7 d，与糖尿病肾病组相比，干细胞移植组大鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数降低，体质量增加。在干细胞移植后14、21 d，与糖尿病肾病组相比，干细胞移植组大鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数降低，体质量稍有升高。这与周虹等[8]研究结果一致。干细胞移植后21 d，在肾脏可发现少量BrdU标记的阳性细胞，糖尿病肾病组和干细胞移植组较正常对照组肾小球体积明显肥大、基质增多，干细胞移植组较糖尿病肾病组肾脏病理状况有所改善。研究结果提示，人UC-MSCs经体外扩增、培养，通过尾静脉输注入糖尿病肾病大鼠体内后，能够归巢于肾脏组织，并在一定程度上改善糖尿病肾病的症状及病理改变。

虽然动物实验已证实骨髓MSCs治疗糖尿病肾病有效，但由于MSCs尚缺乏特异性标志物，各文献对MSCs鉴定方法不一致，如有以CD29、CD44、CD105等表面标志物阳性，CD34、CD45阴性，对MSCs进行鉴定，亦有应用CD44、CD71、CD105等表面标志物阳性，而CD34、CD45阴性对MSCs进行鉴别。且分离纯化技术尚存缺陷，具体哪种干细胞参与肾脏哪些细胞的修复尚不清晰，研究结果可能存在一定差异，所以建立统一的分离体系，建立分离纯化的统一标准，可推进干细胞研究的进一步深入。

本研究就人UC-MSCs体外扩增培养移植入糖尿病肾病大鼠体内对糖尿病肾病的疗效进行了初步探索，发现UC-MSCs在体内能趋化到糖尿病肾病大鼠肾脏，可以在一定程度上改善糖尿病肾病，为UC-MSCs治疗糖尿病肾病提供理论依据，但其作用机制有待更加深入的研究。

[1] 颜小华,陈晓.脐血间充质干细胞静脉移植治疗新生大鼠缺血缺氧性脑损伤[J].中国新生儿科杂志,2006,21(3):158-161.

[2] Shi M,Li J,Liao L,et a1.Regulation of CXCR4 expression in human mesenchymal stem cells by cytokine treatment:role in homing efficiency in NOD/SCID mice[J].Haematologica,2007,92(7):897-904.

[3] 张冰,李文庆.人脐带源间充质干细胞向急性肾损伤肾脏的归巢及保护作用[J].中国组织工程研究,2015,19(45):7304-7308.

[4] 李芳,胡祥,贾丹兵,等.人脐带间充质干细胞在急性肾小管坏死模型犬的体内分布及趋化性[J].中华细胞与干细胞杂志(电子版),2011,1(1):31-38.

[5] 汤杰印.间充质干细胞移植对阿霉素肾病的肾脏保护作用[J].临床内科杂志,2015,32(8):563-565.

[6] Lee R H,Seo M J,Reger R L,et a1.Muhipotent stromal cells from human mal TOW home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(46):17438-17443.

[7] Ezquer F E,Ezquer M E,Parrau D B,et al.Systemic administration of multipotent mesenchymal stromal ceHs reverts hyperglycemia and prevents nephropathy in type 1 diabetic mice[J].Biol Blood Marrow Transplant,2008,14(6):631-640.

[8] 周虹,高赘,田浩明.骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病肾病初探[J].四川大学学报(医学版),2009,40(6):1024-1028.

[9] 刘伯轩.移植骨髓间充质干细胞治疗2型糖尿病肾病的研究[D].太原:山西医科大学,2009.

Therapeuticeffectofumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcellsondiabeticnephropathyinrats

You Guanqiao，Zhang Lina，Tao Lin，Liu Bing

(DivisionofNephrology，HenanProvincialPeople’sHospital，Zhengzhou450003，China)

ObjectiveTo observe the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) on diabetic nephropathy in rats after transplantation.Methods50 male SD rats were randomly selected 10 rats as normal control group. 32 rats with diabetic nephropathy were successfully prepared and randomly divided into diabetic nephropathy group(n=16) and UC-MSCs transplantation group (n=16). UC-MSCs were cultured, identification, labeled by 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) in vitro, which (cell number 2×106) were then transplanted into the rats of UC-MSCs transplantation group by tail vein. The rats of normal control group and diabetic nephropathy group were injected with equivalent serum free L-DMEM culture medium. The same injection was repeated 7 days later. The blood glucose, body weight, 24 h urinary protein, creatinine clearance rate(Ccr) and profile of kidney hypertrophy(KW/BW) were measured at 7,14,21 days after the last injection. The pathological changes of kidney and the survival of labeled stem cells were observed.ResultsAt each observation point, compared to normal control group, blood glucose, urine protein, Ccr and KW/BW were significantly higher, body weight were lower in UC-MSCs transplantation group and diabetic nephropathy group(P<0.05). After 7 days of transplantation, compared to diabetic nephropathy group, blood glucose was lower in UC-MSCs transplantation group(P<0.05), body weight, urinary protein, Ccr and KW/BW were no significant difference between UC-MSCs transplantation group and diabetic nephropathy group(P>0.05). After 14 days, 21 days of transplantation, compared to diabetic nephropathy group, blood glucose group rats, urinary protein, Ccr decreased in UC-MSCs transplantation group(P<0.05), body weight increased slightly in UC-MSCs transplantation group(P>0.05), KW/BW was decreased in UC-MSCs transplantation group(P>0.05). After 21 days of transplantation, a small of positive cells by BrdU labeled can be observed in the kidney tissues in UC-MSCs transplantation group. Compared to diabetic nephropathy group, the glomerular hypertrophy and basement membrane thickening of the UC-MSCs transplantation group were improved.ConclusionUC-MSCs can track to the kidney of diabetic nephropathy in rats after transplantation, which can improve diabetic nephropathy to some extent.

umbilical cord-derived mesenchymal stem cells；diabetic nephropathy；stem cells transplantation

R 587.2

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.19.001

2017-05-19)

河南省医学科技攻关计划普通项目(201303117)。

刘冰，E-mail：Bingliu6699@126.com。