醋制香附不同提取部位对肝郁血瘀模型大鼠的的影响
2017-10-19季宁平周莉江严鑫卢君蓉王世宇傅超美
季宁平,周莉江,严鑫,卢君蓉,王世宇,傅超美
·药理毒理·
醋制香附不同提取部位对肝郁血瘀模型大鼠的的影响
季宁平,周莉江,严鑫,卢君蓉,王世宇*,傅超美
目的:建立具有中医证候特点的肝郁血瘀大鼠模型,探究醋香附治疗肝郁血瘀的有效物质基础,筛选其疏肝散瘀有效部位。方法:采用外界随机刺激造模法及盐酸肾上腺素所致的肝郁血瘀造模法,从体征变化、血液流变学两方面指标评价醋香附不同提取部位疏肝解郁化瘀的药效学差异性,筛选出最佳活性部位。结果:给药后,醋香附不同提取部位组大鼠各项指标均有所改善。体表瘀斑消散、乙酸乙酯组、乙醚组、正丁醇组能显著性降低全血切变率1的水平,乙酸乙酯组亦能显著性减低全血切变率5的水平(与模型组比较,P<0.05);石油醚组、乙醚组、正丁醇组可显著性降低血浆粘度及红细胞压积水平(与模型组比较,P<0.05);乙酸乙酯组、水提组只能降低红细胞压积水平(与模型组比较,P<0.05);正丁醇组、水提组可显著性降低血沉方程K值和红细胞聚集指数(与模型组比较,P<0.05);石油醚组能显著性升高全血高切还原粘度(与模型组比较,P<0.05);石油醚组、乙醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组、水提组可显著性减低血浆纤维蛋白原水平(与模型组比较,P<0.05))。结论:乙酸乙酯部位及石油醚部位为醋香附疏肝散瘀的主要有效提取部位,初步认为醋香附是通过降低血液中的血浆纤维蛋白原、降低血液黏度以达到活血化瘀的功效。
醋香附;提取部位;有效部位;活血化瘀
香附来源于莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根茎,其性平,味辛, 微苦、微甘,主要具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的功效[1]。传统中医理论认为“七情变化,疏泄失职,气机郁结不畅,多责之于肝”, 肝气郁滞会导致气机失调,血液运行不畅,从而出现血瘀证、郁证等。《本草蒙筌》中记载香附:“若理气疼,醋炒尤妙”。香附经醋制后,可增强其疏肝解郁、活血散瘀之功效。目前以醋香附为焦点,从化学成分变化、药理药效作用机理,胃肠吸收等差异,以及谱效结合等,正向多元化评价进行,旨在揭示醋香附的药理药效,及醋制增效机理,但由于其物质基础研究不完善,阻碍了相关研究的深度进行,这也是当下醋香附研究的热点之一[2]。因此本文凭借“肝郁气滞”、“大怒致瘀”及“寒凝气滞血瘀”等中医理论,采用外界随机刺激造模法及盐酸肾上腺素复制肝郁血瘀大鼠模型[3-4],并观察醋香附不同提取部位对血瘀证的影响,比较醋香附不同提取部位疏肝解郁化瘀的药效学差异性,筛选出最佳活性部位。
1 仪器与材料
1.1 动物
清洁级SD大鼠70只,雌雄各半,体重250~270 g,四川省医学院动物研究中心提供(SPF级),合格证号:SCXK(川)2013-15。
1.2 仪器
全自动血细胞分析仪(上海东湖仪器试剂科技有限责任公司,MEK-6318K)、血液流变分析仪(天津市唐宇医疗器械科技发展有限公司,KIV型),雪花制冰机(美国Sciencetool圣斯特,ST200),电子称(购于常熟市双杰测试仪器厂,JJ600Y型,编号:220611040170)。
1.3 试药
醋香附饮片(四川省新荷花中药饮片股份有限公司,批号:D1207095),盐酸肾上腺素注射液(天津金耀药业有限公司,批号:140531),柴胡舒肝丸(天津天士力(辽宁)制药有限责任公司,批号:140408),乌拉坦、吐温-80、95%乙醇、石油醚(60~90 ℃)、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯,均购于成都市科龙化工试剂厂。
2 实验方法
2.1 醋制香附不同提取部位药液的制备
将醋香附饮片粉碎过三号筛(目),100 g,用10倍量70%乙醇回流提取3次,每次1小时,合并滤过,回收乙醇,得浸膏,备用。
石油醚提取部位的制备:取适量70%乙醇提取浸膏混悬于水溶液中,使其浓度相当于原生药1 g.mL-1,取1/3水溶液体积的石油醚重复多次萃取,至石油醚层无色,收集石油醚萃取液,浓缩得到石油醚提取浸膏。
乙醚提取部位的制备:将石油醚萃取后的水层,挥去石油醚至无石油醚味后,取适量乙醚重复多次萃取,至乙醚层无色,收集乙醚萃取液,浓缩得到乙醚提取浸膏。
乙酸乙酯提取部位的制备:将乙醚萃取后的水层,挥去乙醚至无味后,取适量乙酸乙酯重复多次萃取,至乙酸乙酯层无色,收集乙酸乙酯层萃取液,浓缩得到乙酸乙酯提取浸膏。
正丁醇提取部位的制备:将乙酸乙酯萃取后的水层,挥去乙酸乙酯至无味后,取适量正丁醇进行多次重复萃取,至正丁醇层无色,收集正丁醇层萃取液,浓缩得到正丁醇提取浸膏。
水提部位的制备:正丁醇萃取后的水层,挥去正丁醇至无味后,备用。将70%乙醇提取后的药渣,用10倍量的水进行煎煮提取3次,将3次水煎液合并滤过,合并萃取后剩余的水层,浓缩获得水提浸膏。
石油醚部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提部位:取适量的相应提取浸膏,用3%吐温-80溶液溶解,得到相当于原生药1.74 g.mL-1浓度的溶液,备用,灌胃前恢复温度至37℃。
柴胡舒肝丸的制备:取柴胡舒肝丸6 g,用研钵磨成细粉后,取适量加入3%的吐温-80溶液20 mL研磨溶解成浓度为0.25 g.mL-1的均匀混悬液,置冰箱中备用,灌胃前恢复温度至37 ℃。
2.2 动物分组及模型建立[5-7]
2.2.1 动物分组 取SD大鼠(雌雄各半)80只,按体重随机分配为石油醚组、乙醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组、水提组、阳性给药组(柴胡舒肝丸)、空白对照组、模型组共8组,每组10只。
2.2.2 造模与给药 进行适应性饲养2日后,除空白对照组外,采用外界刺激结合药物刺激多种方法进行轮流交替刺激法进行造模,包括夹尾激怒、悬尾、昼夜颠倒、皮下注射盐酸肾上腺素、鼠笼倾斜刺激、禁食禁水、冰水游泳、超声刺激等多种刺激连续进行15日。第16日起,阳性给药组灌胃剂量为用临床等效剂量的 10 倍量,即 1 g.kg-1;醋香附的不同提取部位组分别按照2010 年版《中国药典》规定剂量的20 倍量,即按3.56 g.kg-1灌胃给药。空白组和模型组大鼠给予等体积的生理盐水,连续7日。
夹尾激怒:采用2种夹尾激怒方式,一种为将带棉布的夹子对每只大鼠分别进行夹尾5 min,让各大鼠之间因疼痛而相互打架;另一种为各组中随机抽取2只大鼠进行夹尾刺激,通过这两只大鼠而激怒其余同组的大鼠进行刺激。
悬尾刺激:大鼠头部向下悬挂离地面30 cm,使其挣扎保持试图逃跑却无法逃跑的状态保持15 min,保持悬挂状态。
昼夜颠倒:使大鼠生活环境呈昼夜颠倒状态24 h。
皮下注射盐酸肾上腺素:对大鼠进行皮下注射盐酸肾上腺素,给药剂量为0.1 mL.(200)g-1。
鼠笼倾斜刺激:将鼠笼倾斜放置,保持与地面呈30°的倾斜角度,使笼中大鼠处于随时因笼体斜置而四肢抓笼的状态,保持24 h。
冰水游泳:将制冰机制备成的碎冰放入水桶中,加水至水深50 cm,将大鼠放入水中,使其挣扎游泳。
超声波刺激:将大鼠置于超声波清洗仪旁边,将频率调为60 Hz,使大鼠处于烦躁状态,15 min后,停止刺激。
2.3 评价指标的采集与检测
2.3.1 体征变化 每日称量时注意观察各大鼠耳朵和四肢颜色变化,及其起斑情况。
2.3.2 血液流变学指标的测定 将所采集的血液样本,采用血液流变仪进行样品血液流变学相关参数的测定。
2.4统计学方法
3 试验结果
3.1 体征变化
与空白对照组大鼠相比较,各组大鼠从第4天起出现烦躁不安、易激怒、易相互撕咬的状态,第5天起,毛色开始变黄,且大鼠精神萎靡不振,喜好扎堆,饮食减少,饮水量减少,由于进行给药刺激,造成其急性淤血,大鼠足部及舌头上均出现瘀紫现象,与文献报道的肝郁型血瘀大鼠的体征相吻合,故可认为造模成功。部分各给药组给药后,大鼠的毛色有变光泽趋势,食量增多,扎堆现象减轻,活动量增加,足部瘀斑有消失趋势。模型组,在停止刺激后,有一定的恢复趋势,瘀斑及一般外观状态有一定的改善,但相对于给药组愈后较差。
3.2 醋香附各提取部位对肝郁血瘀模型大鼠对血液流变学的影响
由表1数据分析可知,与空白组相比,模型组中全血切变1、5,血浆粘度、血浆黏度、压积、全血高切相对指数、血沉方程K值、红细胞聚集指数、全血高切还原粘度、红细胞刚性指数、血浆纤维蛋白原水平显著升高(P<0.05),说明造模成功。与模型组比较,乙醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组全血切变率1水平显著降低(P<0.05),具有显著性差异;石油醚组、乙醚组、正丁醇组血浆粘度、压积水平显著降低(P<0.05),具有显著性差异;乙酸乙酯组和水提组虽然与模型组不具有显著性差异,但其数值仍存在降低趋势,表明仍具有化瘀作用,作用较弱。与模型组比较,正丁醇、水提组血沉方程K值及红细胞聚集指数水平显著降低(P<0.05),具有显著性差异;石油醚组、乙醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组、水提组血浆纤维蛋白原水平显著降低(P<0.05),具有统计学意义。在不同提取部位组中,唯石油醚组全血高切还原粘度与模型组比较,有显著差异(P<0.05),具有统计学意义。
表1 醋香附各提取部位对大鼠肝郁血瘀模型的血液流变学值的影响(±s,n=10 )
表1 醋香附各提取部位对大鼠肝郁血瘀模型的血液流变学值的影响(±s,n=10 )
正常对照组 模型组 柴胡舒肝丸组 石油醚组 乙醚组 乙酸乙酯组 正丁醇组 水提组全血切变率1 44.5060±3.0988△ 54.0567±2.3265* 45.8117±1.0089△ 50.5740±6.1144 48.7550±4.53175△ 46.0500±2.55423△ 48.1633±4.14285△ 47.3800±8.38348全血切变率5 17.7380±0.9256△ 20.5683±0.9099* 18.8233±0.6003△ 20.0783±1.9498* 19.5860±1.5387* 18.6320±0.9198△ 19.4300±1.2382 19.0983±2.4242全血切变率30 10.2780±1.5152 9.6367±0.6237 9.9150±0.4792 10.0167±0.9658 9.8300±0.7852 9.4880±0.4178 10.0417±0.4104 10.0533±1.14266全血切变率200 6.6183±1.7833 6.5283±0.37806 6.6683±0.3288 6.8117±0.8566 6.7317±0.7298 6.0567±1.2897 7.0000±0.4079 7.1067±0.9563血浆黏度 1.1567±0.0333 1.4133±0.0320* 1.2800±0.0237*,△ 1.2983±0.0557*,△ 1.2983±0.0431*,△ 1.3333±0.0547* 1.3517±0.0392*,△ 1.3550±0.0394*血沉 2.00±1.00 1.80±0.8367 2.60±1.5166 1 2.20±0.8367 2.25±1.50 1.80±0.4472 1.80±0.4472压积 0.34±0.0237* 0.4983±0.0214* 0.4317±0.0232*,△ 0.4550±0.0281*,△ 0.4267±0.0175*,△ 0.4300±0.0235*,△ 0.4367±0.0197*,△ 0.4400±0.0141*,△全血高切相对指数 4.4620±0.5552 5.4400±0.2468* 5.1460±0.2374△ 5.1560±0.6209 5.2120±0.6199 4.9360±0.3174 5.2400±0.3710* 4.9780±0.3318
注: “*”表示与正常对照组相比,P<0.05,“△”表示与模型组相比,P<0.05。
4 结论与讨论
4.1 肝郁血瘀模型的建立及指标评价
肝郁证候动物模型是研究较为成熟的中医证候模型之一。目前,研究中医的肝郁证候模型更多是从情志因素的影响出发,利用对动物情志上的刺激和折磨进行郁证研究。本试验利用“怒伤肝,久则郁”的原理,结合经典的外界随机刺激造模法及盐酸肾上腺素所致的急性血瘀造模法,形成肝郁型血瘀模型[8-9]。从大鼠外观表征变化到各项血液检查指标,包括全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数、血浆纤维蛋白原等评价指标,其数值大小与血液黏度成正比,其值越小血液黏度越小,对给药组而言,其值越小,药物效果越好。均显示出该造模方法可行、有效。
4.2 醋香附不同提取部位对肝郁血瘀模型大鼠的综合评价
本文以传统中医药理论为指导思想,以中药炮制“醋制入肝”理论为支撑,以疏肝代表药醋香附为研究对象,针对目前醋香附疏肝理气物质基础及其作用机理研究的不足,建立相关病证结合动物模型,设计相关药效学试验,旨在从多角度筛选醋香附的有效部位。
采用大鼠肝郁型血瘀模型,以醋香附的石油醚部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提部位灌胃给药,测定小鼠血液的血液流变学及血常规,采用SPSS统计软件进行数据统计分析,以筛选醋香附疏肝活血化瘀的有效部位。结果表明,各提取有效部位均能在一定程度上对肝郁血瘀行大鼠模型的瘀血情况加以改善,醋香附各提取部位的疏肝散瘀效果由强到弱的排序为:乙酸乙酯部位>石油醚部位>阳性药物>乙醚部位>水提部位>正丁醇部位。其中乙酸乙酯部位及石油醚部位相对于其他提取部位的综合评分较高,故可认为此二者为醋香附疏肝散瘀的主要有效提取部位,可认为醋香附的疏肝散瘀有效部位主要为其极性较小的成分。
[1] 国家药典委员会编,中国药典.一部.中国医药科技出版社.第一版,2010:241.
[2] 王世宇,卢君蓉,陈秋薇,等.香附炮制的历史沿革及现代研究进展[J].中药与临床,2012,2(6):62.
[3] 韩岚,许钒,章小兵,等.桃红四物汤活血化瘀作用的实验研究.安徽中医学院学报,2007,26(1):36.
[4] 罗小泉,陈晓明,万睿,等.中医证候动物模型研制困惑与思考[J].陕西中医.2007,28(12):1657.
[5] 潘素静,龙晓英,陈梓侠,等.活血中药对血瘀和血栓模型作用的比较研究.中药药理与临床,2013,29(5):78.
[6] 韩岚,许钒,章小兵,等.桃红四物汤活血化瘀作用的实验研究.安徽中医学院学报,2007,26(1):36.
[7] 何瑶,傅超美,毛茜,等.四物汤不同提取工艺对血虚模型小鼠造血功能的影响.中国实验方剂学杂志,2012,18(12):198.
[8] 白灵,冯玛莉.中医肝郁证候动物模型研究进展[J].光明中医.2011,26(8):1736.
[9] 周中流,刘永辉.香附提取物的抗抑郁活性及其作用机制研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,(7):191.
(责任编辑:何瑶)
In fl uences of different extracts of Xiangfu prepared with vinegar on liver of rat with liver stagnation and blood stasis /
JING Ning-ping, ZHOU Li-jiang, YAN Xin, LU Jun-rong, WANG Shi-yu, FU Chao-mei//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education;National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources,Chengdu 611137, Sichuan)
Objective:Based on traditional Chinese medicine, rat model of liver disease with liver stagnation and blood stasis was established to explore the material basis for effective treatment of liver stagnation and blood stasis of Xiangfu prepared with vinegar, and screen for the effective parts.Method:The model was established using random stimulating methods and epinephrine hydrochloride. The indexes of sign characteristics, blood rheology were used to evaluate the pharmacodynamics diversity of different extracts of Xiangfu prepared with vinegar and select the best active parts.Result:The indicators were improved after drug administration including dissipating of the surface ecchymosis. Ethyl acetate group, ether group and n-butanol group signi fi cantly decreased the level of blood shear rate 1 compare to model group (P<0.05). Ethyl acetate group also signi fi cantly reduced the level of blood shear rate 5 (P<0.05). Petroleum ether group, ether group, n-butanol group significantly decreased the level of plasma viscosity and hematokrit level (P<0.05). Ethyl acetate group, water extract group only reduced the level of hematokrit (P<0.05).N-butanol group, water extract group signi fi cantly reduced K value of erythrocyte sedimentation rate and red cell assembling index(P<0.05). Petroleum ether group signi fi cantly increased whole blood higher shear reductive viscosity (P<0.05). Petroleum ether group,ether group, ethyl acetate group, n-butanol group, water extract group signi fi cantly reduced the level of plasma fi brinogen(P<0.05).Conclusion:The best active parts were ethyl acetate extract and petroleum ether. It suggests that Xiangfu prepared with vinegar plays a role in promoting blood circulation to remove blood stasis by decreasing plasma fi brinogen and blood viscosity in the blood.
Xiangfu prepared with vinegar; extract parts; effective parts; promoting blood circulation to remove blood stasis
R 285.5
A
1674-926X(2017)02-016-04
国家自然科学基金青年基金项目 (81303227); 成都中医药大学科技发展基金 ( ZRQN1412);成都中医药大学校基金(ZRQN1653)
成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地,四川 成都 611137
季宁平(1989-),助教,从事中药新制剂、新剂型、新工艺研究,Tel:13882189250 Email:504749915@qq.com
王世宇,教授,从事药事管理学、中药新剂型研究,Tel:028-61800231 Email:497217505@qq.com
2016-12-05