左金丸对胃热证大鼠炎症因子、氧化应激因子及凋亡因子的影响

周祥羽，岳贺，李春苑，龚梦鹃，王淑美，梁生旺，邹忠杰

·药理毒理·

左金丸对胃热证大鼠炎症因子、氧化应激因子及凋亡因子的影响

周祥羽1,2,3，岳贺1,2,3，李春苑1,2,3，龚梦鹃1,2,3，王淑美1,2,3，梁生旺1,2,3，邹忠杰1,2,3

目的：探讨左金丸干预大鼠胃热证的作用机制。方法：将大鼠随机分成正常组、模型组和左金丸组，通过灌胃辣椒煎液和无水乙醇建立大鼠胃热证模型，采用酶联免疫吸附法（ELISA）和化学比色法测定各组大鼠血清中的炎症因子如白细胞介素（IL）-2、IL-6、IL-10、IL-1β和髓过氧化物酶（MPO）；氧化应激因子如还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）和凋亡因子如B细胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）的活性或含量。结果：左金丸能显著减少胃热证大鼠胃黏膜损伤面积，显著升高胃热证大鼠血清中GST、GSH-Px、CAT、SOD活性和GSH、IL-10、Bcl-2的含量，显著降低胃热证大鼠血清中MPO活性和IL-2、IL-6、IL-1β、MDA的含量。结论：左金丸可通过抗炎、抗氧化应激和抗凋亡作用干预胃热证。

左金丸；胃热证；抗炎；抗氧化；抗凋亡

左金丸源自朱丹溪的《丹溪心法•火六》，方由黄连、吴茱萸（6:1）组成，具有泻火疏肝、和胃止痛的功效，用于肝火犯胃、胃失和降所致的脘胁疼痛、口苦嘈杂、呕吐吞酸等，主治胃实热证。临床上要用于肝火犯胃型急慢性胃炎、反流性食管炎、功能性胃肠疾病、慢性萎缩性胃炎、消化道溃疡等的治疗。现代药理研究表明左金丸具有调节中枢、抑杀幽门螺杆菌（Hp）、调节体温、调节胃肠蠕动、抑制胃酸分泌、抗溃疡、抗炎镇痛等作用[1]。此外，左金丸能显著减少胃热证大鼠胃黏膜损伤，降低其血清中白细胞介素（IL）-8、IL-2、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、血栓素B2（TXB2），前列腺素E2(PGE2)[2]和6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）的水平[3]。

在前期的研究工作中，我们利用代谢组学的方法证实左金丸可以有效干预胃热证大鼠紊乱的糖代谢、脂质代谢和氨基酸代谢[4]。本研究旨在从抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡三个不同角度系统性的探讨左金丸治疗胃热证的作用及其机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，体重200±10g，购自中山大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK（粤）2012-0125，饲养于广东药科大学实验动物中心屏障环境设施中。动物自由摄食饮水，饲养温度为22℃，空气湿度为50%左右，光照 12 h，黑暗12 h。

1.2 药物

黄连和吴茱萸饮片购自广州采芝林药店，经广东药科大学中药学院韩彬教授鉴定为正品。黄连和吴茱萸以6:1混合粉碎，10倍量蒸馏水浸泡1 h，煎煮2 h，双层纱布滤过出药汁，药渣再加8倍水煎煮2 h，滤出药汁，合并两次药汁， 加热挥发至浓缩液（0.14 g生药．mL-1）。辣椒粉加8倍量蒸馏水煎煮2次，每次1 h，合并提取液，浓缩成8%的煎液。

1.3 试剂

无水乙醇，天津大茂化学试剂厂，分析纯，批号20150503；甲醛，天津福晨化学试剂厂，批号20150107；水合氯醛，天津大茂化学试剂厂，批号20150318。白细胞介素（IL）-2、IL-6、IL-10、IL-1β、髓过氧化物酶（MPO）、还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）和B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要仪器

UV1102II型紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），1-14型低温离心机（德国 Sigma 公司），ELX800型酶标仪（美国BioTek公司）。

2 方法

2.1 动物分组与给药

SD大鼠24只，适应性喂养3 d后，随机分成3组：正常组、模型组和左金丸给药组。模型组与左金丸组大鼠灌胃给予辣椒煎液（10 mL．kg-1），每天2次，连续6天，禁食不禁水24 h后，第7天，灌服1mL无水乙醇，正常组灌服等量蒸馏水。从第4天开始，左金丸给药组灌胃给予左金丸水提液（1.4 g．kg-1），每天1次，正常组和模型组灌胃给予等量蒸馏水。

2.2 样本采集

末次给药后1 h，各组大鼠以10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血。收集的血液样品经凝固（4℃,60 min）后离心（3500 r．min-1, 15 min, 4℃）得到血清，置于-80℃冰箱中保存备用。大鼠处死后切腹取胃，向胃内注射10%的甲醛进行固定，10 min后沿胃大弯部剪开，冲洗干净，展平后拍照，用ImageJ（National Institutesof Health，USA）软件计算大鼠胃黏膜损伤面积。

2.3 胃黏膜组织病理学检测

取代表性部位，10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察。

2.4 血清炎症因子、氧化应激因子及凋亡因子检测

化学比色法测定GSH、MDA、NO含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD、MPO活性，ELISA测定IL-2、IL-6、IL-10、IL-1β、Bcl-2含量。具体操作严格按照试剂盒说明进行。

2.5 统计学处理

实验结果以 ±s表示，数据处理采用SPSS 18.0 统计软件， 组间比较采用单因素方差分析，两两数据比较用Turkey检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 胃黏膜损伤情况

肉眼观察，正常组动物胃黏膜光滑完整，无溃疡面和出血点；模型组动物胃黏膜表面充血水肿、糜烂，有大量点状或线状出血点和溃疡；左金丸给药组动物胃黏膜光滑，表面有散在的出血点、溃疡点，损伤面积较模型组显著减少（P＜0.05，图1）。

图1 各组大鼠胃黏膜损伤面积±s，n=8）

3.2 胃黏膜组织病理学变化

正常组可见胃黏膜层由黏膜下层、肌层及浆膜层组成，结构清晰，层次分明；模型组可见黏膜坏死脱落，溃疡形成，间质出现水肿，细胞间隙增宽明显，炎细胞浸润广泛；左金丸组可见胃黏膜浅层有细胞脱落，无明显溃疡形成（图2）。

图2 左金丸对胃热证大鼠胃黏膜组织病理学变化的影响（HE染色，×100）

3.3 左金丸对胃热证大鼠血清炎症因子的影响

模型组较正常组血清IL-2、IL-6、IL-1β水平和MPO活性显著升高（P＜0.05），IL-10水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，左金丸组IL-2、IL-6、IL-1β水平和MPO活性显著降低（P＜0.05），IL-10水平显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 左金丸对胃热证大鼠血清IL-2、IL-6、IL-10、IL-1β含量和MPO活性的影响±s，n=8）

表1 左金丸对胃热证大鼠血清IL-2、IL-6、IL-10、IL-1β含量和MPO活性的影响±s，n=8）

注：与正常组比较*P＜0.05；与模型组比较#P＜0.05

IL-6(pg．mL-1)组别 IL-2(pg．mL-1)IL-10(pg．mL-1)IL-1β(pg．mL-1)MPO(U．L-1)正常组 94.23±15.81 48.33±1.88 30.56±1.13 33.77±7.68 32.74±6.53模型组 237.20±43.37* 57.97±8.61* 23.38±2.68*53.74±10.68 *63.91±16.35*左金丸组 106.25±45.85# 47.24±3.81# 27.47±1.57# 39.88±5.68# 45.83±7.32#

3.4 左金丸对胃热证大鼠氧化应激因子的影响

如表2和3所示，与正常组相比，模型组大鼠血清GSH含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD活性明显降低（P＜0.05），NO含量和氧化产生的MDA显著升高（P＜0.05）。左金丸组较模型组GSH含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD活性明显升高（P＜0.05），NO、MDA含量显著降低（P＜0.05）。

表2 左金丸对胃热证大鼠血清GSH含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD活性的影响（±s，n=8）

表2 左金丸对胃热证大鼠血清GSH含量和GST、GSH-Px、CAT、SOD活性的影响（±s，n=8）

注：与正常组比较* P＜0.05；与模型组比较# P＜0.05

SOD(U．mL-1)正常组 14.96±1.59 30.17±3.99 4584.42±298.38 7.82±0.47 354.69±6.44模型组 7.71±1.56* 19.62±1.75* 3501.30±209.70* 6.13±0.32* 289.91±4.40*左金丸组 11.46±2.66# 25.49±2.75# 4579.22±100.23# 7.14±0.71# 349.38±12.29#组别 GSH(mg．L-1)GST(U．mL-1)GSH-Px(U．0.1mL-1)CAT(U．mL-1)

3.5 左金丸对胃热证大鼠凋亡因子的影响

模型组较正常组大鼠血清中Bcl-2含量显著降低（P＜0.05），左金丸组较模型组大鼠血清Bcl-2含量显著升高（P＜0.05）。见表3。

表3 左金丸对胃热证大鼠血清MDA、NO和Bcl-2含量的影响（±s，n=8）

表3 左金丸对胃热证大鼠血清MDA、NO和Bcl-2含量的影响（±s，n=8）

注：与正常组比较* P＜0.05；与模型组比较# P＜0.05

组别 MDA(nmol．mL-1)NO(μmol．L-1)Bcl-2(pg．mL-1)正常组 7.36±0.43 5.38±2.11 26.76±4.39模型组 14.51±0.74* 8.20±0.93* 16.84±3.78*左金丸组 7.59±0.36# 5.53±1.76 # 25.31±4.46#

4 讨论

大鼠胃热证胃黏膜的损伤主要表现为胃黏膜充血、炎性渗出、溃疡等病理改变，炎性因子的水平变化与大鼠胃热证密切相关。炎性因子中MPO活性是评价中性粒细胞在组织中浸润程度的可靠指标，IL-2，IL-6和IL-1β促炎因子的增多，将加重炎症的发展，抗炎因子IL-10在炎症消除过程中发挥重要作用，IL-2，IL-6和IL-1β等促炎因子同时能促进诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生大量NO导致组织损伤。在炎症反应过程中，炎症介质起着复杂的网络级联作用，因而某一种炎症介质被拮抗或抑制，整个炎症反应过程将被减轻或阻断，本实验中，模型组大鼠血清中MPO的活性，IL-2，IL-6，IL-1β和NO的含量与正常组大鼠相比有明显增高，IL-10明显降低。而左金丸组大鼠血清中MPO的活性，IL-2，IL-6，IL-1β和NO的含量与模型组大鼠相比有明显降低，IL-10含量明显升高。说明左金丸通过抑制促炎因子和促进抗炎因子释放达到减轻炎症反应的效果。

大鼠胃热证主要表现为胃黏膜的组织损伤，而活性氧（reactive oxygen specie，ROS）会造成生物膜过氧化，导致细胞功能障碍，甚至变性坏死。MDA在血清中含量高低提示机体膜系统损害程度及脂质过氧化程度，SOD和CAT是机体抗氧化系统的要成员，能使自由基引起的组织损伤减轻，其活力大小间接反应了机体抗氧能力。GSH，GST和GSHPx含量是衡量机体抗氧化效果的重要指标。本试验模型组大鼠与正常组大鼠相比，血清中MDA的含量明显增高，SOD，CAT，GSH-Px，GST活性和GSH含量明显降低，表明胃热证大鼠体内产生了大量的ROS，而体内的抗氧化酶不足以消除过量的ROS。左金丸组大鼠与模型组大鼠相比，血清中MDA显著下降，SOD、GSH-Px、CAT、GST活性和的GSH含量明显升高，这表明左金丸可以通过干扰ROS连锁反应的启动和蔓延过程，有效清除大鼠除体内过量的ROS，在抗氧化方面来治疗胃热证。

Bcl-2能抵抗多种形式的细胞凋亡，通过干扰细胞色素C的释放而阻断上游caspase 蛋白酶的激活，抑制细胞的凋亡，本实验中，模型组大鼠与正常组大鼠相比，血清中Bcl-2明显降低，说明胃热证大鼠体内细胞凋亡加重，Bcl-2与激活的促凋亡蛋白发生相互作用后 ,便丧失了对细胞凋亡的抑制作用，造成线粒体等细胞器的功能丧失和细胞器内促凋亡因子的释放，导致细胞凋亡。左金丸组和模型组相比，大鼠血清中Bcl-2明显增多，说明左金丸可有效提升左金丸组大鼠血清中的Bcl-2含量，通过抑制细胞凋亡来治疗胃热证。

综上所述，左金丸可有效治疗大鼠胃热证，可能是经过降低炎症反应，减轻氧化应激状态，抑制细胞凋亡三个不同途径干预胃热证的发生和发展。

[1] 赵平,许浚,张铁军,等.“病-证-方-药”结合探析左金丸配伍的科学内涵[J].中国中药杂志,2011,36(23):3380.

[2] 陈艳芬,陈蔚文,李茹柳,等.左金丸与反左金对寒热型胃粘膜损伤炎因子和保护因子的影响[J].中国中西医结合消化杂志, 2003, 11(3):133.

[3] 山丽梅,赵艳玲,孔维军,等.左金丸及其类方对胃热证大鼠胃黏膜损伤及相关因子的影响[J].解放军药学学报, 2010,26(2):99.

[4] Zou Z, Han B, Gong M, et al. NMR-Based Metabonomic Studies on Stomach Heat and Cold Syndromes and Intervention Effects of the Corresponding Formulas[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2014, doi:10.1155/2014/528396.

(责任编辑：陈思敏)

Effect of Zuojin pill on in fl ammatory factors, oxidative stress factors and apoptosis factors in rats with stomach heat syndrome/

ZHOU Xiang-yu1,2,3, YUE He1,2,3, LI Chun-yuan1,2,3, GONG Meng-juan1,2,3, WANG Shu-mei1,2,3, LIANG Sheng-wang1,2,3, ZOU Zhong-jie1,2,3//(1. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006,Guangdong; 2.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong; 3. Engineering . Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006, Guangdong)

Objective:To explore the mechanisms of action of Zuojin Pill on stomach heat syndrome in rats.Method:The rats were randomly divided into normal group, model group and Zuojin pill group. Rat model of stomach heat syndrome was established by gavage of decoction of pepper and absolute ethanol. The contents or activities of in fl ammatory factors such as interleukin (IL)-2, IL-6, IL-10, IL-1β and myeloperoxidase (MPO) and oxidative stress factors such as glutathione (GSH),glutathione-S-transferase (GST), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), nitric oxide(NO) and malondialdehyde (MDA) as well as apoptotic factors such as B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) in rat serum were detected by chemical colorimetry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Result:Zuojin pill can signi fi cantly reduce gastric mucosal lesion areas of rat with stomach heat syndrome. Furthermore, Zuojin pill signi fi cantly increased the activities of GST,GSH-Px, CAT, SOD and the contents of GSH, IL-10, Bcl-2, as well as reduced the activity of MPO and the contents of IL-2, IL-6,IL-1β, MDA in serum of rats with stomach heat syndrome.Conclusion:Zuojin pill exerts its intervention effects on stomach heat syndrome by adjustment of in fl ammatory mediators and apoptotic markers and increasing the ability of anti-oxidative stress.

Zuojin Pill; stomach heat syndrome; anti-in fl ammatory; antioxidant; anti-apoptotic

] A

1674-926X(2017)02-014-04

国家自然科学基金青年基金项目（81403075）；广东省科技计划项目（2012B060300031）

1. 广东药科大学中药学院，广东 广州 510006；2.国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室, 广东 广州 510006；3. 广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006

周祥羽，在读硕士研究生，主要从事中药活性成分及中药新药研究与开发Tel:15318566601 Email:305700713@qq.com

邹忠杰，教授，从事中药药效物质基础研究Tel:13533709258 Email:zouzhongjie@139.com

2016-08-09