人参-附子药对不同配比对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响

曹丽梅，赵萱，李杰，何瑶，傅超美

·药理毒理·

人参-附子药对不同配比对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响

曹丽梅，赵萱，李杰，何瑶，傅超美

目的：研究人参附子药对不同配比对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响，优选参附注射液中人参-附子药对改善慢性心力衰竭的最佳比例，阐明参附药对配伍与疗效的关系。方法：采用腹腔注射盐酸阿霉素(ADR)法建立大鼠慢性心力衰竭(CHF)模型，测定大鼠体重及心脏重量指数(HWI)的变化，HE染色后观察大鼠心肌组织切片病理损伤情况，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测其对抗凋亡基因（Bcl-2）、促凋亡基因（Bax）、细胞色素C( Cytc)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 9（Caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）基因mRNA表达水平的影响。结果：参附注射液组与其药对不同配比组均能不同程度降低慢性心衰大鼠心脏重量指数，解缓心肌冲血程度，上调抗凋亡基因（Bcl-2）表达，下调促凋亡基因（Bax）、细胞色素C( Cytc)、Caspase-9和Caspase-3的表达,抑制线粒体途径心肌细胞的凋亡，其中，以人参-附子1:2配比组作用最强。结论：人参与附子配伍比例为1:2时，抗慢性心力衰竭线粒体途径心肌细胞凋亡的效果最佳，其可能是通过抑制Bcl-2的表达，上调Bax基因表达，来抑制细胞色素C (Cytc)释放，从而降低Caspase-9和Caspase-3的水平，最终抑制慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡,保护心肌，改善心功能。

人参；附子；药对；慢性心力衰竭；心肌细胞凋亡

参附注射液具有回阳救逆，益气固脱功能，临床上被广泛用于肺源性心力衰竭、冠心病慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、急性心力衰竭、休克、缺血再灌注损伤等。心肌缺血、再灌注损伤、心力衰竭病理变化中伴随心肌细胞的凋亡，并受到多种基因的调控。线粒体结构与功能异常，是影响心肌细胞凋亡主要因素[1]。参附注射液对心肌细胞膜系统,特别是线粒体膜具有明显保护作用，这与参附注射液可保护心肌肥大过程中线粒体内、外膜损伤相一致[2]。本论文以参附注射液为载体，以人参-附子药对配伍比例为切入点，研究人参、附子两药味不同配比对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的疗效与剂量的关系，优选人参-附子配伍改善慢性心力衰竭的最优配比。

1 材料

1.1 试验动物

SD大鼠（SPF级），雄性，体重180±20g，动物合格证号：SCXK（川）2015-030，由成都达硕实验动物有限公司提供。

1.2 试验仪器与试剂

CFX96荧光定量PCR扩增仪（美国Bio-Rad荧光定量PCR仪公司）、光学显微镜（日本OLMPUS有限公司）、RM22石蜡切片机（德国Leica仪器有限公司）；BS200S电子天平 (德国赛多利斯仪器有限公司)、55i荧光显微成像系统（日本Nikon有限公司）、Thermo Micro 21R低温离心机（美国Thermo仪器有限公司）、902-ULTS超低温离心机（美国Thermo仪器有限公司）。

盐酸阿霉素够自成都曼思特生物科技有限公司（规格：100mg，批号：PS160614-01）；红参提取物、附子提取物、参附注射液均由四川雅安三九药业有限公司提供（批号分别为：F160511、F160511、15110701004、）；TriPure Isolation Reagent试剂盒 (批号：11667165001)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(批号：04897030001)、FS Universal SYBR Green Master试剂盒（批号：4913914001）均购自德国Roche Applied Science公司。

1.3 人参-附子配伍不同配比样品的制备

分别取适量的红参提取物、黑顺片提取物（浓度为0.1mg．kg-1），配置附子-人参1:1、2:1、1:2样品溶液，取适量过0.22μm微孔滤膜，既得。

2 试验方法

2.1 造模及给药

适应性饲养一周后，将60只SD大鼠随机分为6组，每组10只，分别设为空白组、模型组、阳性对照组（参附注射液组）、人参-附子1:1组、人参-附子1:2组、人参-附子2:1组。参照文献[3]用腹腔注射盐酸阿霉素（ADR）建立慢性心力衰竭大鼠模型。模型组和各给药组大鼠从实验开始后的第2、4天腹腔注射ADR 1 mg•kg-1，第6、8天腹腔注射ADR 2 mg．kg-1，10、12天腹腔注射ADR 3 mg．kg-1，14、16天腹腔注射ADR4mg．kg-1，第16天ADR累计用药剂量达20 mg．kg-1。空白组腹腔注射等量的生理盐水，造模期间大鼠自由进食、饮水。造模一周后，分别腹腔注射液参附注射液（4 mL．kg-1）、人参-附子1:1（相当于生药10 mg．kg-1）、人参-附子1:2（相当于生药15 mg．kg-1）、人参-附子2:1（相当于生药15 mg．kg-1）配伍不同配比组于开始腹腔注射给药4 mL．kg-1，每日一次，连续给药10天。空白组给予等量生理盐水，模型组不做任何处理。

2.2 取材及心脏重量指数（HWI）测定

末次给药后，大鼠禁食不禁水，12小时后，称量大鼠体重（BW），腹腔注射20%乌拉坦（5 mL．kg-1）麻醉大鼠后，解剖大鼠，延主动脉根部游离心脏，去除周围筋膜及脂肪组织，用生理盐水洗净，最后用滤纸吸干表面水分，称量心脏的重量（HW），计算心脏重量指数（HWI,HWI=HW/BW）。随后将心脏分为两部分，分别用于组织病理学损伤评估、心肌组织凋亡调控基因mRNA水平的分析。

2.3 心肌组织切片HE染色

将取下的大鼠心肌组织固定于4%多聚甲醛中（PH:7.2～7.6），经组织修块、蒸馏水冲洗、梯度酒精脱水、石蜡包埋，LEICA切片机切片（5um），HE染色后用中性树脂胶封片，显微镜下观察并记录心脏组织病理学损伤情况。采用显微照相系统进行拍照记录。

2.4 荧光实时定量qRT-PCR法测定心肌组织基因mRNA表达水平

心肌组织经在液氮中碾磨成粉末后，取约100 mg组织粉末约1 ml进行总RNA提取，操作步骤严格按照TriPureIsolation Reagent 试剂盒说明书进行；提取的总RNA采用核酸定量仪对RNA进行定量，按照反转录试剂盒Transcriptorfirst strand cDNA synthesis反转录合成第一链cDNA，具体操作步骤按照试剂盒进行，相关调控基因引物序列见表1-1；取样本cDNA1μL上下游引物各0.5μL，并按照FS Universal SYBR Green Master试剂盒操作要求加入其他成分。样品Bax，Bcl-2，Cytc，Caspase-9，Caspase-3和β-actin循环条件为：95℃预变性2 min，接着进行40循环数，95℃变性10 s，退火（Bax：62.2℃；Bcl-2：62.7℃；Cyt c：63℃；Caspase-9：58.5℃；Caspase-3：61.2℃；β-actin：63℃）30 s；最后95℃延伸15 s。以β-actin作为内参基因，分析上述基因mRNA的相对表达水平。基因扩增的Ct值采用2-△△T法分析。

表1 心肌细胞凋亡线粒体调控基因引物序列

R:ACAGAGCTGGACTGCGGTAT Bcl-2 NM_016993.1F: ACAGCCAGGAGAAATCAAACA R:GGTGGACAACATCGCTCTG Bax NM_017059.2 F: GTCCAGTTCATCGCCAATTC R:CAGGATCGAGCAGAGAGGAT C（Cytc） NM_012839.2 F: TCAATGATGCTGCCTTTCAC R: ACTCCCAATCAGGCATGAAC Caspase-9 NM_031632.1 F:CCACGGACACATGAGGTTGT R:CAGGGCACACATGACAATGC

2.5 数据处理

采用 SPSS20.0 统计分析软件对实验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），多组间均数两两比较，数据以均数±标准差（x±s）表示。

3 试验结果

3.1 动物行为学观察

空白组大鼠体格矫健,神思敏捷，毛发柔顺而有光泽，模型组和其余各药组大鼠在第3次腹腔注射ADR后开始出现病理症状，表现为毛色杂乱无光泽,进食量减少,腹泻，活动量减少,腹部出现硬块,反应迟钝，精神萎靡等。经参附注射液及人参-附子药对配伍不同配比治疗后上述症状较模型组均出现不同程度好转。

3.2 大鼠心脏重量指数（HWI）变化

数据处理结果表明，与空白组大鼠相比，模型组大鼠HWI显著升高（P＜0.01）；参附注射液组、人参-附子1:2组大鼠HWI明显低于模型组（P＜0.01）；人参-附子1:1组、人参-附子2:1组大鼠HWI低于模型组（P＜0.05），详见表3-1。

表2 人参-附子配伍不同配比对大鼠体重及心脏重量指数（HWI）的影响（x±s，n=6）

3.3 大鼠心肌组织HE染色结果

各组试验大鼠心肌组织HE染色结果见图3-1，由图可知，空白组大鼠未见明显的病理损伤，肌间小动脉、小静脉和毛细血管均未见明显扩张，管腔中无红细胞。模型组大鼠心肌组织肌间明显增宽，间质小静脉和毛细血管轻度扩张充有数量不等的红细胞，毛细血管数量明显增多；心肌空泡变性，肌浆内有大小不等的不规则或近圆形空泡。参附注射液组较为接近空白组，有少量心肌细胞出现充血现象。人参-附子1:2组与模型组相比，肌间隙明显变窄，变性心肌细胞及空泡数量显著减少，毛细血管充血程度有一定改善。人参-附子1:1组肌间小动脉、小静脉和毛细血管扩张程度得到很大程度的改善，但是心肌组织充血严重，红细胞及毛细血管数量较多。人参-附子2:1组与模型组相比，肌间小动脉、小静脉和毛细血管均未见明显扩张，变性心肌细胞及空泡数量，炎性细胞浸润程度均未观察到明显变化。

图3-1 心肌组织HE染色结果HE 400×

3.4 对Bcl-2、Bax基因mRNA表达的影响

由表3可知，模型组大鼠心肌组织Bcl-2的表达显著低于空白组（P＜0.01），Bax表达显著高于空白组（P＜0.01）。参附注射液组、人参-附子1:2组Bcl-2表达显著高于模型组（P＜0.01），Bax基因表达水平显著低于模型组（P＜0.01）；人参-附子1:1组、人参-附子2:1组大鼠心肌组织中Bcl-2表达高于模型组和空白（P＜0.05或P＜0.01）；人参-附子1:1组Bax水平低于模型组（P＜0.05），详见表3。

表3 人参-附子配伍不同配比对大鼠心肌组织Bcl-2、Bax基因表达的影响（x±s，n=6）

3.5 对细胞色素C(Cytc)的影响

分析表3-3数据可知，模型组大鼠心肌组织细胞色素C(Cytc)水平显著高于空白组（P＜0.01）；人参-附子1:1组C(Cytc)水平高于空白组（P＜0.05）；参附注射液组、人参-附子1:2组C(Cytc)水平显著低于模型组（P＜0.01）；人参-附子1:1组、人参-附子2:1组C( Cytc)水平低于模型组（P＜0.05），详见表3-3。

表4 人参-附子配伍不同配比对大鼠心肌组织C(Cytc)水平的影响（x±s，n=6）

3.6 对Caspase-9和Caspase-3基因表达的影响

分析数据可知，模型组Caspase-9和Caspase-3基因表达水平显著高于空白组（P＜0.01）；与模型组相比较，参附注射液组Caspase-9和Caspase-3的水平降低（P＜0.05或P＜0.01）；人参-附子1:1组、人参-附子2:1组Caspase-9表达高于空白组，低于模型组（P＜0.01）；人参-附子1:1组Caspase-3表达显著高于空白组（P＜0.01）；人参-附子1:2组Caspase-9和Caspase-9水平与模型组相比，差异显著（P＜0.01），详见表3-4。

表5 人参-附子不同配比对大鼠心肌组织Caspase-9和Caspase-3水平的影响（x±s，n=6）

注：与模型组比较△P＜0.05, △△P＜0.01；与空白组比较*P＜0.05,** P ＜0.01

4 结论与讨论

人参与附子配伍比例为1:2时，抗慢性心力衰竭线粒体途径心肌细胞凋亡的效果最佳，通过抑制慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡,保护心肌，改善心功能。

心肌细胞的凋亡是受基因控制的细胞主动而有序的死亡过程，本论文采用腹腔注射ADR建立经典大鼠慢性心力衰竭，参附注射液组、人参-附子1:2组与模型组相比，Bcl-2表达明显升高（P＜0.01），Bax水平显著降低（P＜0.01）；人参-附子1:1组、人参-附子2:1组大鼠心肌组织中Bcl-2（P＜0.05）高于模型组和空白组（P＜0.05或P＜0.01），人参-附子1:1组Bax水平低于模型组（P＜0.05），说明人参-附子药对配伍不同配比均会影响Bcl-2、Bax基因的表达，人参-附子1:2组与阳性对照组参附注射液作用效果较为接近。

论文中模型组大鼠心肌组织中C( cytc)、caspase-9 和caspase-3的含量显著高于空白组（P＜0.01），推测是由于Bcl-2/Bax比值升高，促使心肌线粒体释放大量C( CytC)，导致caspase基因的激活。推测参附注射液及人参-附子药对不同配比组是通过降低抗凋亡基因Bcl-2表达、提升促凋亡基因Bax表达，从而降低Bcl-2/Bax的比值，最终降低C( CytC)的释放，达到降低caspase-9含量，最终抑制Caspase-3的激活，从而抑制细胞线粒体途径心肌细胞凋亡(Mitochondrial pathway of apoptosis)，保护心肌，延缓心衰的发展，以人参-附子1:2配伍抗心肌细胞凋亡作用最强，提示增加附子得用量可以增强参附药对抗慢性心肌衰竭的功能，这可能与附子补火助阳，温阳强心作用有关。

[1] 唐昱.线粒体介导心肌细胞凋亡的研究进展[J].国外医学.心血管疾病分册,2009,32(5): 259.

[2] 于妍,王硕仁.参附注射液对肥大心肌细胞线粒体内外膜损伤的影响[J].中药药理与临床，2013,29(4): 19.

[3] 苏丹,李鹏飞,张柳,等.阿霉素心肌损伤大鼠模型的制备与评价[J].中国实验动物学报，2009,17(6): 442.

（责任编辑：陈思敏）

Effect of different ration of Renshen-Fuzi on myocardial apoptosis in rats caused by chronic heart failure

Xuan, LI Jie, HE Yao, FU Chao-mei//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To study the effect of different dosage ration of Renshen and Fuzi on myocardial apoptosis in rat with chronic heart failure (CHF), explore the best dosage ration of Renshen and Fuzi in Shenfu Injection and clarify the relationship between compatibility and ef fi ciency.Method:CHF model was established by intraperitoneal injection of doxorubicin hydrochloride (ADR). Weight and heart weight index (WHI) were measured. Cardiac muscle tissue slice pathological injury were observed after HE. The indexes including Bcl-2, Bax, CytC, Caspase-9 and Caspase-3 were measures by qRT-PCR .Result:Shenfu Injection and different dosage ration of Renshen –Fuzi can decrease WHI of CHF rats, relieve myocardial ischemia in different level. They can also increase the expression of antiapoptotic genes (Bcl-2), decline the express of apoptosis gene (Bax),Cytc, Caspase 9, and Caspase 3 to inhibit mitochondrial pathway of myocardial cell apoptosis. Among them, Renshen-Fuzi1:2 group showed the strongest effect.Conclusion:The effect of Renshen –Fuzi 1:2 group on resistance to chronic heart failure mitochondrial pathway of myocardial cell apoptosis is the best. It is probably by inhibiting the expression of Bcl-2, raising Bax gene expression, to suppress the cytochrome C (Cytc) release, thus reduce Caspase - 9 and Caspase - 3 levels, eventually inhibit myocardial apoptosis in chronic heart failure rats and protect cardiac muscle and improve heart function.

Renshen; Fuzi; compatibility; chronic heart failure; apoptosis

/CAO Li-mei, ZHAO

] A

] 1674-926X(2017)02-013-04

国家自然科学基金委青年基金项目编号(81503266)

成都中医药大学药学院，成都 611137

曹丽梅（1991-），在读硕士研究生，主要从事中药新制剂、新技术与新工艺研究Tel:15208307202 Email:410501297@qq.com

赵萱，硕士，讲师，主要从事中药新制剂、新技术与新工艺研究Tel:13982277300 Email:626098860@qq.com

2016-09-15