HPLC法同时测定康复新液中两种成分的含量

石金凤，张臻＊，宋芹，章津铭＊，傅超美，何瑶，刘彬

·炮制制剂·

HPLC法同时测定康复新液中两种成分的含量

石金凤1，张臻1＊，宋芹2，章津铭1＊，傅超美1，何瑶1，刘彬3

目的：建立同时测定康复新液中尿苷和黄嘌呤含量的方法。方法：采用HPLC法，Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色谱柱，甲醇-水(5：95) 作为流动相，于254 nm波长下检测，流速1.0 mL．min-1，柱温30 ℃。结果：尿苷、黄嘌呤分别在0.10～3.96 μg．mL-1（r2=0.9998）、0.52～20.80 μg．mL-1（r2=0.9992）浓度范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为97.86%（RSD=1.25%）、97.39%（RSD= 0.68%）。测定5批次康复新液中尿苷和黄嘌呤的含量范围分别为1.69～1.76 μg．mL-1、12.76～13.06 μg．mL-1，说明各批样品质量较均一。结论：本文建立的方法精密度高、重复性好，操作简便快速，可用于康复新液的质量控制。

HPLC；尿苷；黄嘌呤；康复新液

康复新液是昆虫美洲大蠊(Periplaneta americanaL.)干燥虫体的乙醇提取物制成的口服和外用制剂。该药临床应用广泛，效果良好，副作用小，具有通利血脉、养阴生肌等作用。内服可用于瘀血阻滞，胃痛出血，胃，十二指肠溃疡；以及阴虚肺痨，肺结核的辅助治疗。外用可用于金疮，外伤，溃疡，瘘管，烧伤，烫伤，褥疮之创面[1]。同时它对化疗性疾病、妇科疾病，小儿手足口等病也具有较好疗效[2～4]。康复新液中化学成分较复杂，主要为多元醇类、核苷类、肽类、粘糖氨酸、多种氨基酸等小分子类成分[5]，这对康复新液的质控带来困难，其现有质量标准[6]仅以测定总氨基酸含量来评价制剂品质的高低，难以达到全面质量控制的目的。

核苷类成分为美洲大蠊的抗炎成分之一[7]，同时核苷类物质不仅是构成核酸 RNA、DNA单体的前体，也是生物氧化、能量代谢中的能源物质和抗病毒、抗肿瘤药物的中间体，具有重要的生物活性[8]。其中，尿苷和黄嘌呤是主要的核苷成分，常被用于作为动物药的质控指标，如地龙[9]、海马[10]、冬虫夏草[11]等。目前尚未见有将尿苷、黄嘌呤两种成分作为康复新液质量控制方式的报道，因此本文旨在采用高效液相色谱仪（HPLC）建立一种同时测定康复新液尿苷和黄嘌呤的分析方法，用以更好地控制和完善康复新液的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DL-720D数控超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；UPH-I-10T优普超纯水器（成都超纯科技有限公司）；BS200S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；SSI series 1500高效液相色谱仪（美国SSI公司）；Diamonsil C18（250×4.6mm，5μm）色谱柱。

1.2 试药

康复新液（规格：100mL/瓶 四川好医生攀西药业有限责任公司 批号分别为：140230、140905、150353、150723、151001）；尿苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：N-025-150730）；黄嘌呤对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：H-069-150729）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；超纯水（成都超纯科技有限公司）；三氯甲烷、盐酸等其他试剂均为分析纯（成都科龙化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-水（5∶95）；体积流量1.0 mL．min-1；检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

取尿苷和黄嘌呤对照品，精密称定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成浓度分别为尿苷19.80 μg．mL-1、黄嘌呤104.00 μg．mL-1的混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取康复新液20 mL，加三氯甲烷12 mL、1 mol．L-1盐酸3.4 mL，搅拌至析出的晶体完全溶解，置分液漏斗中，弃去三氯甲烷，再用三氯甲烷8 mL，洗涤，弃去三氯甲烷，重复两次。精密量取6 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按处方比例制成不含康复新的阴性样品，并按”2.3”供试品溶液的制备项下方法制得阴性样品溶液。

2.5 线性关系的考察

精密吸取上述对照品贮备液0.05，0.1，0.25，0.5，1，2 mL，分别至10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制得不同浓度梯度标准溶液。分别吸取10 μL进样，以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。见表1。

表1 线性范围考察结果

2.6 专属性试验

取阴性样品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按“2.1”项下色谱条件测定，见图1。

图1 阴性样品（A）、混合对照品（B）和康复新液样品（C）的HPLC色谱图

可见阴性样品溶液在此条件下在与尿苷、黄嘌呤对照品相同的保留时间处未见干扰峰出现，表明其专属性良好。

2.7 精密度试验

取对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，以峰面积计算，见表2。尿苷、黄嘌呤的RSD分别为：1.64%、1.81%，实验结果表明仪器精密度良好。

表2 精密度试验数据表

2.8 重复性试验

取同一批号的供试品溶液20 mL，共6份，按照供试品溶液的制备和检测方法制备样品溶液并进行检测，结果见表3。尿苷、黄嘌呤的平均含量分别为1.72 μg．mL-1、13.06 μg．mL-1，RSD分别为1.32%、1.92%，表明本方法重复性良好。

表3 重复性试验数据表

2.9 稳定性试验

取同一份康复新液供试品溶液，按试验所得方法，分别于0，2，4，6，8，10，12 h取10 μL进样，结果见表4。供试品溶液中尿苷、黄嘌呤的峰面积RSD 分别为1.69%、1.90%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

表4 供试品稳定性试验数据表

2.10 加样回收率试验

精密称取尿苷对照品1.0 mg加入10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作为尿苷对照品储备液；精密称取黄嘌呤对照品5.5 mg加入50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，再吸取上述溶液4 mL至10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作为黄嘌呤对照品储备液。精密量取康复新液样品10 mL共9份，每组分别加入一定量的尿苷对照品储备液和黄嘌呤对照品储备液，使其含量分别达到样品中尿苷和黄嘌呤含量的80%、100%、120%，每个浓度做3份，均照样品含量测定项下制备供试液，再按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表5。

表5 加样回收率试验结果 (n=6)

9 17.20 20.64 37.49 98.3 1 130.60 104.48 231.74 96.8黄嘌呤2 130.60 104.48 232.89 97.9 3 130.60 104.48 232.57 97.6 4 130.60 130.60 259.24 98.5 5 130.60 130.60 256.89 96.7 6 130.60 130.60 258.72 98.1 7 130.60 156.72 282.93 97.2 8 130.60 156.72 282.30 96.8 9 130.60 156.72 282.46 96.9 97.39 0.68

实验结果显示尿苷和黄嘌呤的平均回收率分别为97.86%、97.39%，RSD分别为1.25%、0.68%，表明所建立方法可满足实验要求。

2.11 样品含量测定

取5个批次的样品，按“2.3”项下方法制备溶液，按“2.1”项下色谱条件及方法测定样品中的尿苷和黄嘌呤的含量，结果见表6。

表6 5批康复新液样品含量测定结果（n=3）

实验结果表明，5批康复新液中尿苷的含量范围为1.69～1.76 μg．mL-1，黄嘌呤的含量范围为12.76～13.06 μg．mL-1，各批次中尿苷和黄嘌呤含量较均一、稳定。

3 讨论

康复新液中含一定的附加剂，如果样品不经处理，对尿苷和黄嘌呤含量测定会带来很大干扰，因此要除去溶液中的附加剂。通过多次考察试验，康复新液20 mL，加1 mol．L-1的盐酸3.4 mL，分别用三氯甲烷12 mL，8 mL，8 mL萃取洗涤三次即可。

在研究中，筛选了甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、含0.07%冰醋酸的3%甲醇溶液三个流动相系统；考察了甲醇-水（2:98）、甲醇-水（5:95）、甲醇-水（10:90）三个流动相比例；考察了0.6mL．min-1、0.8mL．min-1、1.0mL．min-1三个流速。结果表明：除了甲醇-水系统能实现将两种成分分离，其余流动相系统均不能实现对两种成分的分离。甲醇-水系统能够得到基线平稳、稳定性好、分离度好、色谱峰峰形较好的HPLC图谱。在流速小于1.0mL．min-1时，尿苷和黄嘌呤2种核苷类成分出峰时间稍长，峰宽较宽；而选择1.0mL．min-1的流速时，两种成分能够在10 min内快速同时分离。

本品为动物类中成药，其质量标准难以控制产品质量，目前康复新液质量标准[6]采用单一成分丙氨酸为对照品，对总氨基酸进行测定，利用茚三酮比色法，由于不同氨基酸所显颜色不尽相同，导致该法专属性不强，也不够准确；另一方面茚三酮显色不稳定，受外界及试剂因素的影响较大，且对环肽和内酰胺类化合物需特殊处理，操作较为复杂。采用 HPLC 法测定康复新液中尿苷和黄嘌呤的含量，具有精密度高，回收率和专属性好的优点，符合《中国药典》2015年版四部通则高效液相色谱法的各项要求，可作为提高康复新液质量标准的检测指标。

[1] 国家药品监督管理局国家药品标准[S]. WS3-B-3674-2000.

[2] 舒崇湘, 冉新泽, 程天民, 等. 全身放射损伤对皮肤伤口组织细胞的影响及康复新的促愈作用[J]. 中国临床康复, 2003,7(11): 1644.

[3] 王静. 康复新液治疗慢性宫颈炎的临床观察[J]. 中外健康文摘, 2007, 4(1): 29.

[4] 谢杨学, 何淑君. 康复新液治疗小儿手足口病疗效分析[J].现代预防医学, 2012, 39(1): 52.

[5] 焦春香, 刘光明, 周萍. 天然药物康复新的研究进展[J]. 时珍国医国药, 2008, 19(11): 2623.

[6] 中国人民共和国卫生部. 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂. 第19册[S]. 北京:人民卫生出版社,1998:176.

[7] 肖小琴, 汪世平, 徐绍锐, 等. 美洲大蠊提取物抗炎、镇痛作用的实验研究[J].中国病原生物学杂志, 2007, 2(2): 140.

[8] 冷玲颖, 蔡志强, 孙铁民. 核苷类抗病毒前药的研究进展[J].中国药物化学杂志, 2008, 18(4): 310.

[9] 李伟, 文红梅, 钟进, 等. HPLC测定地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷的含量[J]. 中药材, 1996, 19(12): 625.

[10] 赵晓莉, 崔小兵, 狄留庆, 等. HPLC法测定海马中次黄嘌呤、黄嘌呤的含量[J]. 中药材, 2002, 25(10): 716.

[11] 靳丹虹, 梁芳慧, 董丽丹, 等. RP-HPLC 测定冻干鹿茸中的尿嘧啶和尿苷[J]. 现代科学仪器, 2013, (2): 141.

（ 责任编辑：何瑶）

Simultaneous determination of two components in Kangfuxin Ye by HPLC/

SHI Jin-feng1, ZHANG Zhen1, SONG Qin2,ZHANG Jin-ming1, FU Chao-mei1, HE Yao1, LIU Bin3//(1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2.College of bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, Sichuan;3. Sichuan good doctor Pharmaceutical Group Co., Ltd, chengdu 610075, Sichuan).

Objective:To establish a method to detect xanthine and uridine content in Kangfuxin Ye at the same time.Method:HPLC method was established. The separation was carried out on a Diamonsil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm)at 254 nm. The mobile phase was consist of MeOH and H2O (5:95) at the fl ow rate of 1 mL．min-1, and the column temperature was set at 30℃.Result:The linear ranges of uridine and xanthine were 0.10～3.96 μg．mL-1(r2=0.9993) and 0.52～20.80 μg．mL-1(r2=0.9991), respectively. The average recoveries of uridine and xanthine were 97.86% (RSD=1.25%) and 97.39% (RSD=0.68%),respectively. The method was applied in the determination of 5 batches of Kangfuxin Ye. The content ranges of uridine and xanthine were1.69～1.76 μg．mL-1and 12.76～13.06 μg．mL-1, respectively, which suggested that the quality of each batch was uniform.Conclusion:The method has high precision, good repeatability, simple and rapid operation. It can be used to control the standard of Kangfuxin Ye.

HPLC; uridine; xanthine; Kangfuxin Ye

R 283.6

A

1674-926X(2017)02-010-04

成都中医药大学科技发展基金（030018052）

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2. 成都大学生物工程学院，四川 成都 610106；3.四川好医生药业集团有限公司，四川 成都 610075

石金凤（1993-），女，汉，重庆垫江人，中药药剂学专业在读硕士研究生，研究方向为中药新制剂， Email:191006842@qq.com

1.张臻（1987-），女，汉，四川乐山人，讲师，中药药剂学， Email:zhangzhendr@126.com 2.章津铭（1987-），男，汉，四川内江人，讲师，中药药剂学， Email:zhangjinming1987@126.com

2016-11-24