液相色谱-质谱法测定人体血浆中非那雄胺含量

金 懿, 贺云彪, 姚慧平, 冯晓亮, 黄兰芳*

(1.衢州学院化学与材料工程学院,浙江衢州 324000; 2.常德市食品药品检验所,湖南常德 415000)

非那雄胺片是一种四氮杂甾体化合物，适用于治疗和控制良性前列腺增生症(BPH)[1]，是目前治疗良性前列腺肥大最有效和应用最广泛的药物[2 - 3]。因为非那雄胺内酰胺结构碱性极弱，无法采用非水滴定法测定其含量。此外非那雄胺只存在末端吸收，不能用紫外分光光度法测定其含量，通常采用高效液相色谱法[4 - 6]、液质联用法[7 - 10]和极谱分析法[11]等测定其含量。其中以Constanzer等人建立的血浆中非那雄胺的液相色谱/大气压化学电离质谱(LC/APCI-MS)测定方法较好，测定灵敏较高,其最低定量浓度为0.2 μg·L-1，但该方法用固相萃取处理血浆样品，操作较繁琐[7]。

本文采用电喷雾离子源，以卡马西平作为内标，建立了简便、灵敏、准确、选择性好的测定人体血浆中非那雄胺浓度的液相色谱-质谱法，用于受试制剂给药后的人体药代动力学研究,结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC/MS-2010型液相色谱-质谱联用仪(日本，岛津公司)；2.2.5 XW-80A旋涡振荡器(上海医科大学仪器厂)。

非那雄胺对照品(纯度≥99%，杭州仙琚制药有限公司生产)及受试制剂(杭州仙琚制药有限公司生产，规格:5 mg/tablet)，均由常德市食品药品检验所提供；内标卡马西平购自Sigma公司。非那雄胺和内标卡马西平储备液(0.1 mg·mL-1)用甲醇配制并保存于4 ℃冰箱中；非那雄胺和卡马西平工作液(1.0 μg·mL-1)用甲醇稀释储备液配制。色谱纯乙腈和甲醇购于江苏汉邦科学技术有限公司；三氟乙酸(TFA)购自Merck公司，所有水溶液用二次蒸馏水配制。溶剂用0.22 μm微孔滤膜过滤并经脱气处理。

1.2 液相色谱-质谱分析条件

色谱条件：色谱柱为Hypersil-Keystone C18柱(150×2.1 mm i.d.,5 μm)，色谱柱前用Waters C18小柱保护(Waters,Milford,MA,美国)，柱温：40 ℃；流动相为乙腈∶水(含0.2%TFA)=55∶45(V/V)，流速为0.2 mL·min-1;进样量为5 μL。

质谱条件：电喷雾正离子源(ESI+)；选择性离子模式(SIM)检测。非那雄胺m/z:373[M+H]+；卡马西平(内标)m/z:237[M+H]+。离子源温度为380 ℃；脱溶剂和加热块温度分别为250 ℃和210 ℃；源电压:4.5 kV；检测电压：1.5 kV；脱溶剂电压：-18 V；Q-阵列偏转电压：45 V；雾化气(N2)流速:4.5 L·min-1。

1.3 样品的处理

取0.2 mL血浆样品，置于Eppendorf离心管中，加入1.0 μg·mL-1内标卡马西平使用液10 μL，旋涡混匀，加入0.2 mL乙腈，旋涡混匀30 s，静置10 min后，以3 000 r·min-1离心15 min，将上清液转移至另一Eppendorf离心管中，于50 ℃水浴中以氮气吹干。残渣用100 μL流动相溶解后，以13 000 r·min-1离心5 min，取上清液5 μL直接进样分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

高效液相色谱法用于非那雄胺分析的报道较多，一般采用乙腈和水作流动相，紫外检测器检测，但方法的灵敏度不高，且选择性较差。本文优化了色谱条件，如水、乙腈和三氟乙酸(TFA)的含量，当流动相为乙腈∶水(含0.2%TFA)=55∶45(V/V)时，非那雄胺和内标的分离最佳。

2.2 质谱条件的优化

分别试验了大气压化学电离和电喷雾离子化两种方式，以离子极性为正离子的电喷雾离子化为佳，非那雄胺和内标卡马西平都以[M+H]+为基峰，其m/z分别为373和237，以选择离子模式(SIM)检测用于非那雄胺的定量分析，最佳的质谱检测条件见1.2节。非那雄胺标准溶液和内标在正离子SIM模式下的LC/ESI-MS总离子流(TIC)色谱图如图1所示。

2.3 方法的专属性

按照选定的色谱和质谱条件，分别对空白血浆、加入内标和非那雄胺标准溶液的血浆、口服非那雄胺的血浆样品进行测定。在SIM模式下的LC/ESI-MS总离子流色谱图(TIC)如图1中A、B、C。非那雄胺及内标的保留时间分别为5.07、2.95 min。在前述色谱条件下，非那雄胺和卡马西平(IS)峰形良好且基线平稳，与血浆中内源性杂质达到基线分离。

图1 空白血浆(A)、血浆加内标和30·ng mL-1非那雄胺对照品(B)及服药后血浆(C)总离子流(TIC)色谱图Fig.1 TIC chromatograms of blank plasma(A),blank plasma spiked with finasteride(30 ng·mL-1) and IS(B),and human plasma sample after administration of finasteride and spiked with IS(C) 1:carbamazepine(IS);2:finasteride.

2.4 标准曲线

用空白血浆将非那雄胺标准溶液稀释成不同浓度(0.2、0.5、10、20、60、80、120、140 ng·mL-1)，加入卡马西平使每一空白血浆配制的非那雄胺标准溶液中内标浓度为50 ng·mL-1，按1.3样品处理方法处理后，用LC/ESI-MS法分析以绘制标准曲线。当非那雄胺的浓度在0.5～120 ng·mL-1范围时线性关系良好，其线性回归方程为：y=0.0449+0.0307x(y为非那雄胺和卡马西平的峰面积比，x为非那雄胺浓度(ng·mL-1))，相关系数r为0.999，采用向空白血浆中添加标准溶液的方法，以3倍信噪比(S/N=3)确定检出限为0.02 ng·mL-1。

2.5 精密度和准确度

用空白血浆将非那雄胺标准储备液稀释成低、中和高三个不同浓度(2、60、100 ng·mL-1)，加入卡马西平使内标浓度为50 ng·mL-1，按样品处理方法处理后作为质量控制样品。日内精密度(RSD)和准确度(RE)经对质量控制样品在1 d内6次重复测定，日间的精确度和准确度则是对质量控制样品连续6 d分析测定，计算方法的日内、日间的精确度和准确度，结果见表1。日间和日内测定的精密度分别在6.4%～2.2%和5.5%～1.7%之间，日间和日内测定的准确度分别为-1.8%～7.5%和-0.41%～6.0%之间。

表1 质量控制样品的日内及日间精密度与准确度(n=6)Table 1 Intra-day and inter-day precision and accuracy of quality control samples(n=6)

2.6 稳定性

用空白血浆将非那雄胺标准储备液稀释成20 ng·mL-1的标准溶液，加入卡马西平使内标的浓度为50 ng·mL-1，按样品处理方法处理后，依次于0、2、4、6、12、24 h时进样检测，测定非那雄胺浓度,得RSD为0.37%。表明该溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 回收率

用空白血浆将非那雄胺标准储备溶液分别配制成0.5 ng·mL-1、40 ng·mL-1和80 ng·mL-1低、中和高3个浓度，加入卡马西平使内标浓度为50 ng·mL-1，按样品处理方法处理后，连续进样6次，测定回收率，平均回收率分别为108.5%、101.2%和98.7%。

2.8 方法的应用

图2 受试者给药5 mg非那雄胺后血浆中非那雄胺的平均浓度-时间的关系曲线Fig.2 Curve of plasma mean concentration-time for volunteers after oral administration of a single 5 mg finasteride tablet

选用24名男性健康受试者，年龄18～25岁,身高165～186 cm,体重60～85 kg。受试者在试验前进行体格检查,肝肾功能、心率、呼吸、血压及心电图均正常。受试者试验前两周及试验期间未服用过其他任何药物。禁食12 h后清晨空腹口服剂量为5 mg试验药品,用温开水吞服。受试者在服药期间禁烟、酒，服药后2 h给予统一低脂肪饮食。血样自给药前和给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、16、24 h从静脉采血5 mL。将血样标本置于肝素化的试管中立即离心(3 000 r·min-1,10 min)分离出血浆，-20 ℃保存。用该方法测定血浆中非那雄胺的浓度及受试制剂给药后的人体药代动力学研究，受试制剂给药后的血药浓度对时间曲线见图2。

3 结论

提出了一种简单、灵敏、快速分离测定人体血浆中非那雄胺浓度的方法。人体血浆样品经用乙腈去蛋白、离心和吹干后,残渣用流动相溶解，以乙腈∶水(含0.2%TFA)=55∶45(V/V)为流动相，在Hypersil-Keystone C18色谱柱上分离，卡马西平作内标，用电喷雾离子源(ESI)和选择离子检测方式(SIM)作定量分析。该法已成功用于人血浆中非那雄胺浓度的测定和人体药代动力学研究，能满足体内低药物浓度测定及药代动力学、生物等效性的研究。