超高效液相色谱-串联质谱测定芝麻酱中16种真菌毒素

郭礼强，崔晓娜，丁葵英，孙朝红，王亮亮，刘春雪

（1.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊 261041；2.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

超高效液相色谱-串联质谱测定芝麻酱中16种真菌毒素

郭礼强1*，崔晓娜2，丁葵英1，孙朝红1，王亮亮1，刘春雪1

（1.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊 261041；2.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

建立了芝麻酱中16种真菌毒素（赭曲霉毒素A、T-2毒素、伏马菌素B2、伏马菌素B1、O-甲基杂色曲霉素、蛇形菌素、新茄镰孢菌醇、杂色曲霉素、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、曲酸、青霉酸、橘青霉素、黄曲霉毒素M1）多残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLCMS／MS）的检测方法。芝麻酱样品经乙腈-水-乙酸（80∶19∶1，体积分数，下同）溶液提取，QuEChERS方法净化后，以含0.1%甲酸的水溶液与乙腈为流动相，经ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）分离，以多级反应监测（MRM），外标法定量。结果表明：16种真菌毒素的检出限为0.03～1.5μg／kg，定量限为0.10～4.0μg／kg；线性范围在0.10～200μg／kg内各成分的线性相关系数均大于0.991；样品在定量限1倍、2倍和10倍3个添加水平下的平均回收率为70.7%～99.2%，相对标准偏差（RSD）为3.26%～10.5%。该方法简便、灵敏、快速，可用于芝麻酱中多种真菌毒素污染的监控分析。

芝麻酱；真菌毒素；液相色谱-串联质谱；分散固相萃取

真菌毒素是某些真菌（霉菌）在农作物、谷物或食品中繁殖代谢产生的一些次级代谢产物，这些真菌毒素污染食品被人类食用后会引起中毒，毒性大的甚至会导致癌症、畸形，严重威胁消费者的生命，如黄曲霉毒素B1是目前已知的化学物质中致癌性极强的一种，是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。真菌毒素的产生主要来自于农作物田间、运输及储存阶段有毒真菌的侵染、繁殖和扩散［1，2］，受环境影响因素很大，然而文献已报道的300～400种真菌毒素［3］，只在少数食品或饲料中得到了监管。已有的对真菌毒素的研究主要在小麦、玉米、花生和食用油方面，防止其进入食物链，而对于调味品污染真菌毒素的检测方法由于研究和检测技术的不成熟而少有报道。芝麻的生长周期和环境需求与花生类似，营养成分比较全面，也易污染真菌毒素。黄声灵等［4］在湖北省32份芝麻样品中检出19个属共80个种的真菌，其中就有多种产毒菌属，如杂色曲霉属、黄曲霉属等。赵辉等［5］在我国6个芝麻主产区的13个广泛栽培的芝麻品种中检出多种产毒菌属，如在芝麻种子外部和内部均检出镰孢属、曲霉属和青霉属等产毒菌属。2016年1月份，武汉市食品药品监督管理局对本市芝麻酱进行抽查检测，发现5%的芝麻酱中黄曲霉毒素B1超标。若芝麻收获期间气候潮湿多雨或芝麻运输、储存方式不正确，会很容易产生真菌毒素。由于真菌毒素一般对光、热和酸稳定，芝麻中的真菌毒素会残留在产品芝麻酱中。

目前，真菌毒素的检测方法主要有免疫法［6］、液相色谱法［7－9］和液相色谱-串联质谱法［10－19］。免疫法检测速度快，仪器简单易携带，但一般是检测的辅助手段，特异性和灵敏度较差。液相色谱法使用比较普遍，但选择性较差，多种毒素同时检测受到限制。液相色谱-串联质谱法选择性好，操作简单，通量高，可以实现对多种目标分析物同时检测。本文选取易污染芝麻酱的多种真菌毒素为研究对象，结合Qu ECh ERS前处理净化技术，建立了16种真菌毒素的UPLC-MS／MS检测方法。该方法简单、方便，有很强的可操作性，可实现多种真菌毒素的同时定性定量分析，对食品企业及政府相关执法部门提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-线性离子阱质谱联用仪：Waters Utra Performance LC／Qtrap 5500（美国Waters公司／美国AB公司），配电喷雾离子源（ESI）；离心机：5810R型（德国Eppendorf公司）；氮吹仪：N-EVAP型（美国Organomation Associates公司）；纯水机：Milli-Q型（美国Millipore公司）；超声波清洗器：KQ-500型（昆山市超声仪器有限公司）。

曲酸（Kojic acid）、青霉酸（Penicillic acid）、O-甲基杂色曲霉素（O-Methylsterigmatocystin）、杂色曲霉素（Sterigmatocystin）、伏马菌素B1（Fumonisin B1）、伏马菌素B2（Fumonisin B2）：购于Sigma公司；橘青霉素（Citrinin）、黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1）、黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）、黄曲霉毒素B2（Aflatoxin B2）、黄曲霉毒素G1（Aflatoxin G1）、黄曲霉毒素G2（Aflatoxin G2）、蛇形菌素（Diacetoxyscirpenol）、新茄镰孢菌醇（Neosolaniol）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）、T-2毒素（T-2 toxin）：均购于Biopure公司；QuEChERS净化包（WondaPak）：购于日本Shimadzu公司；乙腈、乙酸乙酯、甲醇和甲酸（均为色谱纯）：德国Merck公司。

用乙腈配制浓度分别为100μg／L的各真菌毒素标准溶液，再根据需要用芝麻酱提取液稀释成适当浓度的混合标准工作液，在4℃下保存，有效期3个月。

1.2 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；柱温：40℃；流动相A：0.1%甲酸-水，流动相B：乙腈；流速：0.3 m L／min；进样量：10μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3 质谱条件

大气压电喷雾电离源（ESI），正离子电离模式；干燥气：10 L／min；干燥温度：350℃；喷雾气：50 psi；毛细管电压：3500 V；多反应监测模式（MRM）；16种真菌毒素的部分质谱参数见表2。

表2 16种真菌毒素的部分质谱参数Table 2 Some parameters of MS for 16 mycotoxins

续 表

1.4 样品处理

准确称取（2±0.01）g均匀的芝麻酱样品，置于50 mL离心管中，加入10 m L乙腈-水-乙酸（80∶19∶1，体积比，下同）溶液涡混1 min，以10000 r／min离心10 min，转移上清液6 m L至10 m L洁净玻璃试管中，加入200 mg ODS涡旋振荡均匀，静置5 min分层，取5 m L上清液至洁净的10 m L玻璃试管中氮气吹干，用1 m L初始流动相溶液溶解，涡混振荡均匀，过0.22μm微孔滤膜后，经UPLC-MS／MS分析测定。

2 结果与讨论

2.1 提取净化

提取溶剂对目标分析物的回收率有一定影响，查阅文献，主要为甲醇-水和乙腈-水。对比了甲醇-水和乙腈-水2种提取溶剂对16种真菌毒素回收率的影响，数据表明使用乙腈-水作为提取溶液真菌毒素回收率好于以甲醇-水作为提取溶液，和多数文献提取方法吻合。进一步考察了提取溶液酸碱度对回收率的影响，实验发现赭曲霉毒素A和蛇形菌素在碱性条件下易分解，造成回收率不稳定，实验比较了甲酸、乙酸和盐酸3种试剂对目标提取物回收率的影响，结果发现乙酸对赭曲霉毒素A和蛇形菌素的回收率最好，经过梯度添加最终确定在提取溶液中加入1%乙酸。芝麻易侵染多种产毒真菌，而免疫亲和柱和多功能净化柱受真菌毒素种类限制，使用成本高，且不能对多种真菌毒素同时净化，本文引用Qu ECh ERS方法，通过基质加标后用QuEChERS法净化，发现净化效果很好，以赭曲霉毒素A举例，结果见图1。

图1 芝麻酱样品经QuEChERS净化前（a）和净化后（b）赭曲霉毒素A质谱图Fig.1 Mass spectra of Ochratoxin A in sesame paste（a）before and（b）after QuEChERS purification

2.2 色谱条件的优化

流动相的组成和配比对目标分析物有显著影响，试验发现在水相中加入甲酸可以显著提高真菌毒素MRM的响应值，同时对比了甲醇和乙腈2种有机相对目标分析物提取离子流图的影响，发现乙腈作有机相各真菌毒素有更好的响应值，试验经过反复摸索确定了表1所述流动相比例梯度和流速，应用该方法各真菌毒素的色谱峰峰形良好。

2.3 质谱条件的优化

以两通代替色谱柱，分别将100μg／L的16种真菌毒素的标准品溶液通过自动进样器以5μL／min的流速直接注入质谱离子源，得到各目标分析物碎片离子信息，确定定量离子对和定性离子对，优化各质谱参数，16种真菌毒素优化的MRM质谱参数见表2，各真菌毒素的提取离子流图见图2。

图2 16种真菌毒素混合标准溶液的MRM图Fig.2 MRM chromatograms of mixed standard solution of 16 mycotoxins

2.4 方法的线性关系和检出限

将16种真菌毒素质量浓度在0.03～200μg／L之间的一系列混合标准溶液（用空白芝麻酱提取液配制）进行质谱测定，分别以测得的各真菌毒素化合物峰面积的平均值Y对质量浓度X（μg／L）绘制标准曲线，所有相关系数（r）均大于0.991。以3倍信噪比（S／N）响应值所对应的浓度作为方法的检出限（LOD），以10倍信噪比（S／N）响应值所对应的浓度作为方法的定量限（LOQ）。16种真菌毒素的线性方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限数据指标见表3。

表3 16种真菌毒素的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限（n＝6）Table 3 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of 16 mycotoxins（n＝6）

2.5 方法的回收率及精密度

分别在芝麻酱基质中添加1倍、2倍和10倍定量下限浓度的真菌毒素混合标准物质，每种浓度做6个平行实验，计算各种真菌毒素的回收率和精密度（相对标准偏差）。16种真菌毒素3个添加水平下的平均回收率为70.7%～99.2%，相对标准偏差（RSD）为3.26%～10.5%，结果见表4。

表4 16种真菌毒素的加标回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of 16 mycotoxins（n＝6）

续 表

2.6 实际样品测定

对市场上购买的10份芝麻酱中的真菌毒素含量进行了测定，从一份芝麻酱样品中检测到O-甲基杂色曲霉素，检测含量为0.14μg／kg，应引起生产企业和相关监管部门的重视。

3 结论

本文建立了芝麻酱中16种真菌毒素残留的超高效液相色谱-串联质谱快速测定方法，能够实现对16种真菌毒素同时定性定量分析。该方法前处理简单，检测快速，灵敏度高，实用性强，可以满足对芝麻酱中多种真菌毒素残留的检测需求。

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Determination of 16 Mycotoxins in Sesame Paste by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Li-qiang1*，CUI Xiao-na2，DING Kui-ying1，SUN Zhao-hong1，WANG Liang-liang1，LIU Chun-xue1
（1.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，China；2.Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang 261061，China）

A method is established for the determination of 16 mycotoxin residues in sesame paste，including Kojic acid，Penicillic acid，O-Methylsterigmatocystin，Sterigmatocystin，Fumonisin B1，Fumonisin B2，Citrinin，Aflatoxin M1，Aflatoxin B1，Aflatoxin B2，Aflatoxin G1，Aflatoxin G2，Diacetoxyscirpenol，Neosolaniol，Ochratoxin A，T-2 toxin using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）.The sesame paste is purified with Qu ECh ERS method after extraction by acetonitrile water solution（80∶19∶1）with 1%（V／V）aceticacid，and then being separated on a ACQUITY UPLC BEH C18column（2.1 mm×50 mm，1.7μm）using gradient elution with the mobile phase of water solution with 0.1%formic acid and acetonitrile.A multiple reaction monitoring（MRM）is as survey scan with external standard method.The results indicate that the limits of detection（LOD，S／N＝3）for 16 mycotoxins are 0.03～1.5μg／kg，the limits of quantification（LOQs，S／N＝10）are 0.10～4.0μg／kg.The range of 0.10～200μg／kg for 16 mycotoxins has good linear relationship（r＞0.991）.The average recoveries（n＝6）of the 16 mycotoxins in sesame paste samples at one，two and ten addition levels of LOQ range from 70.7%to 99.2%with the relative standard deviations（RSDs）between 3.26%and 10.5%.The method is convenient，sensitive and quick，which could satisfy the demands for determination of mycotoxin residues in sesame paste.

sesame paste；mycotoxin；liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）；dispersive solid-phase extraction

TS264.2

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.034

1000-9973（2017）10-0154-06

2017－04－18 *通讯作者

潍坊市科学技术发展计划（2014RKX094）；山东省高等学校科技计划（J16LE52）

郭礼强（1980－），男，山东潍坊人，工程师，硕士，研究方向：食品中农、兽药残留和真菌毒素的检测。