辣泡菜中乳酸菌的筛选以及理化性质的鉴定

冯爱娟，谢汝祝，任海琪，叶茂*

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广州 510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广州 510300）

辣泡菜中乳酸菌的筛选以及理化性质的鉴定

冯爱娟1，2，谢汝祝1，任海琪1，叶茂1，2*

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广州 510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广州 510300）

以辣泡菜中的乳酸菌作为研究对象，从3批不同来源的材料中筛选出11株乳酸菌，经过对比产酸量，最后筛选2株产酸量较高的菌株。通过形态特征、菌落特征、生理生化特征等初步鉴定，结果表明2株菌均可以进行乳酸发酵，其中R菌株为Lactobacillus plantarum，HPC7菌株为Bacillus toyonensis。

乳酸菌；泡菜；筛选

作为乳酸菌发酵蔬菜制品的泡菜一直深受我国各族人民喜爱，具有开胃、降低胆固醇和抗癌等保健作用，在人们的生活中起着重要的作用。目前家庭和工厂大多采用的是自然发酵生产泡菜，这种方法微生物种类多，发酵周期较长，发酵过程不容易控制，同时会产生亚硝酸盐，对人们的身体有害，造成了严重的食品安全问题，严重制约了泡菜的大量生产。本研究以市场和韩国料理门店的各种泡菜作为样品，对其中的乳酸菌进行分离和鉴定，分析菌种的特征，为泡菜发酵产业积累菌种。本实验对自然发酵泡菜中的乳酸菌进行研究，对提高蔬菜制品的营养价值，改善蔬菜制品的风味和延长食品的保质期有着积极意义，为酸菜的纯菌发酵和现代工业生产奠定基础［1］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

口味纯正的韩国泡菜、市场泡菜。

1.1.2 培养基成分

蛋白胨，牛肉粉，酵母粉，K2HPO4，柠檬酸三铵，CH3COONa·3H2O，葡萄糖，吐温80，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O盐溶液。

1.1.3 试验试剂

乙二胺四乙酸二钠，钙黄绿素，甲基红。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的富集与分离初筛

以口味纯正的辣泡菜为乳酸菌分离样品，在无菌条件下操作，称取25 g样品及酱汁接种于富集培养基（MRS液体培养基）中，置于35℃的恒温培养箱中静置培养48 h。将富集培养液进行梯度稀释（稀释到10－6，取10－4～10－6进行涂布）后吸取0.1 m L于分离培养基（MRS培养基中添加1%～3%碳酸钙）上进行涂布分离，恒温培养48 h，挑取产酸量较强的单菌落（以融钙圈大小为标准），在分离培养基中进行划线，筛选出单菌落保藏备用。

1.2.2 菌种保藏

将筛选好的菌株接种到MRS斜面培养基中培养2天，将斜面转移至4℃冰箱中保存。

1.2.3 菌种的复筛

将分离初筛得到的菌株接种到装有50 m L MRS液体培养基的三角瓶中，30℃培养72 h。通过EDTA定钙法［2］（取过滤后的发酵液1.0 m L，加蒸馏水50 m L，加1 mol／L NaOH溶液4.0 m L，钙黄绿素指示剂20 mg，用0.01 mol／L EDTA·Na2溶液滴定至背光观察黄绿色荧光转变为橙色为止，并记录消耗的EDTA·Na2体积（m L），按下式计算乳酸含量：

式中：W为乳酸含量（g／L），V为滴定时消耗的EDTA·Na2体积（m L）。

式中：W1为发酵初的重量；W2为发酵结束后的重量；W为接种量；V为三角瓶最初装液量。定量检测乳酸的含量。

1.3 理化性质的鉴定

1.3.1 产H 2 O2试验

移取5 m L发酵液于试管中，向试管中滴加15%H2O2，若有气泡产生为阳性反应，若无就是阴性反应。

1.3.2 产H 2 S试验

将新鲜培养物接种于培养液后，用无菌的镊子夹取乙酸铅纸条（普通滤纸用50～100 g／L的乙酸铅浸泡，置于烘箱烘干后灭菌备用）悬挂于接种管内，下端接近培养液表面而不接触液面，上端用胶塞塞紧，37℃培养48 h，纸条变黑为阳性反应。

1.3.3 甲基红试验

从保藏的斜面上挑取1环菌株，接种于装有灭好菌的50 m L MRS液体培养基的三角瓶中，于30℃培养箱中培养3天后，每日取培养液1 m L，滴加1～2滴甲基红指示剂，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性呈黄色。直到发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。甲基红为酸性指示剂，p H范围为4.4～6.0，其p K值为5.0。故在p H 5.0以下，随酸度而增强红色，在p H 5.0以上，则随碱度而增强黄色，在p H 5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验［3］。

1.3.4 明胶液化试验

从保藏的斜面中挑取1环菌株，接种于明胶基础培养基中，置30℃培养，以1支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱中，等待对照管凝固后记录试验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应［4］。

1.3.5 柠檬酸盐

取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，36℃培养3～7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。

1.4 菌株的16S r DNA测序

氨氮降解菌菌株的16S r DNA PCR扩增引物采用通用引物：正向引物27F，反向引物1492R（由上海生物工程有限公司合成），扩增产物电泳检测后送上海生物工程有限公司测序将测得序，列通过NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）网站的GenBank核酸序列数据库内进行BLAST比对，找出核酸数据库中与氨氮降解菌菌株同源性较高的菌株序列，下载这些菌株的DNA序列，然后用生物软件MEGA4进行CLUSTAL比对并构建氨氮降解菌菌株的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌种分离

菌株产酸量高低与溶钙圈大小成正比［5］，据此共分离出11株产酸量较高的乳酸菌，编号为R，CP1，CP3，CP7，HPC1，HPC2，HPC3，HPC4，HPC5，HPC6，HPC7。用EDTA定钙法测产酸，其实验结果见表1，结果表明R号菌和HPC7号菌产酸量较大。选这2株菌进行接下来的鉴定等实验。

表1 使用EDTA定钙法测定菌株产酸量结果Table 1 The results of acid production determined by using EDTA calcium method mL

2.2 菌种鉴定

R和HPC7菌株经革兰氏染色后于显微镜下观察，细胞完全或大部分是细杆状，均为紫色，因此均属于革兰氏阳性菌，无芽孢。染色图见图1和图2，试验结果见表2。

图1 R菌株的革兰氏染色图Fig.1 Gram stain of strain R

图2 HPC7菌株的革兰氏染色图Fig.2 Gram stain of strain HPC7

表2 鉴定实验结果Table 2 Results of identification experiment

2.3 菌株R和HPC7的16S r DNA测定结果

将菌株R和HPC7的16S r DNA序列提交到GenBank数据库并构建菌株的系统发育树。

图3 R的16S r DNA序列比对结果Fig.3 16S r DNA sequence alignment results of strain R

由图3可知，R菌株与Lactobacillus plantarum（植物乳杆菌）的亲缘性最近，序列相似度达100%，二者在系统发育树上亦处于同一分支；结合该菌的理化特征可以初步鉴定HRC1菌株属于Lactobacillus plantarum。

图4 HPC7的16S r DNA序列比对结果Fig.4 16S r DNA sequence alignment results of strain HPC7

由图4可知，HPC7属于芽孢杆菌属，与菌株Bacillus toyonensisBCT-7112T的序列相似度达100%，二者在系统发育树上亦处于同一分枝，所以初步确定HPC7菌株为Bacillus toyonensis。

3 结果讨论

从2批辣泡菜样品中分离纯化出11个菌株，在菌落及菌株形态上表现出丰富的微生物多样性，说明不同批次的乳酸菌优势菌株有所不同［6］；而不同批次的乳酸菌菌株的酸性有很大差异，说明附着于不同样品的乳酸菌菌株的酸性有很大差异。试验结果表明：辣泡菜中含有大量的乳酸菌，产生了丰富的乳酸菌种类的多样性，可为腌菜、泡菜等发酵食品微生物菌剂的筛选提供丰富的菌株资源，而且可以作为酸萝卜、辣椒酱等食品的发酵菌株。

以产酸菌株平板筛选出R及HPC7菌株的融钙圈的大小和EDTA定钙法的结果，表明这2株菌可能是产酸能力较强的菌株，但还需对培养条件优化选出最优的培养条件来筛选出产酸能力强的乳酸发酵菌株。

通过一系列的理化鉴定，试验中发现R号菌和HPC7号菌都具备乳酸菌的性能，可初步认定R号菌和HPC7号菌均为乳酸产生菌，可作为发酵食品的菌株。

［1］葛菁萍，邹鹏，宋刚，等.酸菜发酵液中乳酸菌的分离与鉴定［J］.食品工业科技，2007，28（10）：83-84.

［2］樊永红，王丽，柳丹，等.米根霉发酵液中乳酸含量的测定方法研究［J］.生物技术，2007，17（1）：54-55.

［3］时永杰.乳酸菌发酵辣椒酱菌种的筛选及系列辣椒酱产品的研发［D］.石河子：石河子大学，2013.

［4］热娜·米吉提，乌斯满·依米提，周秀文，等.饲料乳酸菌的分离鉴定及优良菌株筛选［J］.生物技术通报，2016（6）：166-168.

［5］盛海圆.传统泡菜中乳酸菌的分离鉴定及其多样性分析［D］.合肥：安徽农业大学，2010.

［6］杨海英，张振宁，佐玉梅，等.腌菜中乳酸菌的分离及产酸菌筛选研究［J］.安徽农业科学，2012（13）：7909-7910.

Selection and ldentification of Physical and Chemical Properties of Lactic Acid Bacteria from Spicy Fermented Vegetables

FENG Ai-juan1，2，XIE Ru-zhu1，REN Hai-qi1，YE Mao1，2*
（1.School of Food and Biological Technology，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China；2.Engineering and Technology Development Center of Special Condiments in Guangdong Colleges and Universities，Guangzhou 510300，China）

The lactic acid bacteria in spicy fermented vegetables are studied，select 11 strains ofLactobacillusfrom 3 batches of different sources of materials as the object of the study.After comparing their acid production，select 2 strains of lactic acid bacteria which produce more acids.Finally，by identifying their morphological feature，colony characteristics and physiological and biochemical characteristics，etc.preliminarily，the result shows that the 2 strains can produce lactic acid and strain R isLactobacillus plantarums，while HPC7 isBacillus toyonensis.

lactic acid bacteria；fermented vegetables；selection

TS201.3

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.031

1000-9973（2017）10-0143-04

2017－04－03 *通讯作者

广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103）；国家青年科学基金项目（31500102）；“创新强效工程”之自主创新能力提升项目（1A10205）

冯爱娟（1976－），女，副教授，博士，研究方向：微生物发酵。