基于大豆粕酶解物美拉德反应制备咸味香精的研究

郑家伦，李晨，陆利霞，熊晓辉

（南京工业大学食品与轻工学院，南京 201611）

基于大豆粕酶解物美拉德反应制备咸味香精的研究

郑家伦，李晨，陆利霞，熊晓辉

（南京工业大学食品与轻工学院，南京 201611）

实验以大豆粕为原料，通过酶解进而利用美拉德反应制备咸味香精。研究了碱性蛋白酶和复合植物水解酶Viscozyme L的添加顺序对酶解液性质的影响。利用HPLC和GC-MS对产物的氨基酸组分及香气成分进行分析。结果表明：先添加底物浓度10%的碱性蛋白酶，再添加底物浓度15%的复合植物水解酶Viscozyme L的酶解效果最佳，此时酶解液水解度是11.64%，还原糖含量为0.674 mg／m L，氨基氮含量为1.553 mg／m L，游离氨基酸总量达到1433.14 mg／g。从美拉德反应液中检测出癸醛、2-癸酮、2-己基呋喃等挥发性化合物物质，它们对肉香味的生成具有重要的作用。

大豆粕；酶解液；美拉德反应

咸味香精包括猪肉香精、牛肉香精、鸡肉香精、羊肉香精等具有肉制品香味的香精和各类海鲜味食用香精［1］，是20世纪70年代兴起的一种新型食品香精，自20世纪80年代开始，我国开始研究咸味食品香精，而20世纪90年代则是我国咸味食品香精快速发展的10年。利用美拉德反应生产咸味香精是目前研究的热点［2］。通过美拉德反应制得的咸味香精比起调配制得的香精，香气更加逼真、饱满且醇厚感更好［3］。控制美拉德反应的原料和反应条件，可以产生不同的肉香味，以美拉德反应为基料的香精质量一般较好［4］。

研究表明：水解动物蛋白、水解植物蛋白、酵母抽提物、废骨提取物、类脂肪质等各种天然原料都可以作为氨基酸来源制取香精香料。植物蛋白有大豆粕、花生粕、小麦面筋和玉米面筋等。其氨基酸成本较低，且原料来源广泛。大豆粕作为植物蛋白的主要来源，价格低廉且营养价值较高，符合现代人对于健康的需求。

本实验以市售食品级大豆粕为原料，依次加入碱性蛋白酶及复合植物水解酶Viscozyme L，以此酶解得到氨基酸和还原糖。实验无需添加任何糖类来满足美拉德反应的条件。探究了两种酶的最佳添加顺序及添加量，利用液相色谱法对酶解液中的游离氨基酸进行分析，利用GC-MS法对美拉德反应产物进行香气成分分析，旨在为大豆粕咸味香精的开发及制备提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆粕（食品级） 市售；Alcalase 2.4 L蛋白酶（2.4 AU-A／G），复合植物水解酶Viscozyme L（100 FEB／g）诺维信公司。

PHS-3C p H计： 上海仪电科学仪器股份有限公司；WSC-S测色差计 上海精密科学仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 南京文尔仪器设备有限公司；紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；反应釜、电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；气质联用仪、AG1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解液的制备

大豆粕溶液中加入复合植物水解酶Viscozyme L，简称V（分别为底物质量的5%，10%，15%），55℃酶解1.5 h，煮沸灭酶后冷却到室温，再加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L，简称A（分别为底物质量的5%，10%，15%）60℃酶解2 h后。煮沸灭酶10 min，酶解液离心取上清液［5］，喷雾干燥制得酶解液干粉。调换复合植物水解酶Viscozyme L和碱性蛋白酶的加入顺序，重复以上实验。

1.2.1.1 碱性蛋白酶水解度的测定

计算方法依据p H-Stat法［6］。

1.2.1.2 酶解液还原糖浓度的测定

利用DNS法对酶解液中的还原糖进行测定［7］。

1.2.1.3 酶解液氨基氮含量的测定

利用甲醛滴定法对酶解液中的氨基氮含量进行测定［8］。

1.2.2 氨基酸组分的测定

采用高效液相色谱法［9］，OPA和FMOC柱前衍生处理。HYPERSIL ODS（C18）色谱柱：250 mm×4.6 mm×5μm；柱温：40℃；流速：1.0 m L／min；紫外检测器：338 nm，262 nm（Pro，Hypro）。

流动相：A相为0.6 mmol／L醋酸钠；B相为0.15 mmol／L乙酸钠∶乙腈∶甲醇为1∶2∶2（V／V／V）；流速为1 m L／min。

流动相：A相为称取5.44 g结晶乙酸钠于1000 mL烧杯中，加入1000 mL水搅拌至完全溶解，再加入200μL三乙胺，搅拌并滴加5%的醋酸，将p H调到7.20±0.05，加入5 mL四氢呋喃，混合后备用。B相为称取5.44 g结晶乙酸钠于800 mL烧杯中；加入200 mL水搅拌至完全溶解；滴加5%醋酸将p H调到7.20±0.05；将此溶液加入400 mL乙腈和400 mL甲醇，混合后备用。

氨基酸分析梯度洗脱表见表1。

表1 氨基酸分析梯度洗脱表

1.2.3 美拉德反应制备

咸味香精取1 g酶解液干粉，以水料比10∶1加水，将溶液置于反应釜内，将反应釜放入120℃的烘箱内加热1.5 h。

1.2.4 褐变程度的测定

将样品分别用去离子水稀释至一定的倍数，在420 nm和294 nm下测定吸光值A420和A294，重复测定3次［10］，取平均值。A420nm处的吸光值代表美拉德反应后期棕褐色物质的形成程度，A294nm的吸光值代表美拉德反应中间产物的形成程度。

1.2.5 色差值的测定

采用色差计测量反应体系中色泽的变化［11］，取1.0 m L样品注入直径2.5 cm的样品槽中。本体系提供3种颜色属性，其中L*（光度，正值白，负值黑），a*（正值红，负值绿），b*（正值黄，负值蓝）。以水为参照，计算相应参数：饱和度C＝（a2＋b2）1／2；总色差ΔE＝（ΔL2＋Δa2＋Δb2）1／2。

1.2.6 顶空固相微萃取

提取挥发性成分在20 m L的顶空瓶中装入5 m L大豆粕咸味香精，将顶空瓶放入55℃恒温水浴中平衡30 min，再将已老化好的SPME针头插入样品瓶中，用手柄将石英纤维头暴露到顶空气体中萃取30 min后，用手柄使纤维头推回到针头内拔出针头，将吸附了分析组分的萃取头插入GC-MS进样器中，使待测组分解吸，进入GC-MS进行分离与分析［12］。

1.2.7 气相色谱-质谱（GC-MS）联用分析

1.2.7.1 气相色谱条件

色谱毛细管柱为DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25μm）；载气为He，流速1.8 m L／min；不分流；程序升温，起始温度40℃，保持3 min，以5℃／min的速率升温到80℃，以10℃／min的速率升温到160℃，保持0.5 min，以2℃／min的速率升温到175℃，后以10℃／min的速率升温到230℃，最后在230℃保持7 min；汽化室温250℃［13］。

1.2.7.2 质谱条件

EI电离源，电子能量70 e V，灯丝发射电流35μA，离子源温度200℃，接口温度250℃，检测器电压350 V，扫描质量范围35～450 m／z。

1.2.7.3 挥发性化合物的鉴定

以1.00 mg／m L 1，2-二氯苯甲醇为内标，确定挥发性化合物含量。根据GC-MS分析对大豆粕咸味香精中挥发性化合物鉴定，将分离出的化合物的质谱数据与经计算机检索标准谱图库相匹配［14］。

1.2.8 感官评定

通过鲜味溶液来进行评定［15］，鲜味溶液由1.0%MSG和0.5%食盐配制而成。各美拉德反应液按0.5%的比例加入鲜味溶液中，60℃恒温水浴加热10 min，进行感官评定。由经训练过的有咸味风味剂评定经验的6位感官评定员（3男3女）根据所提供的评价指标对样品进行评定，打分采用7分制，将麦芽糊精的对照溶液设定为3分，分值越大表明作用效果越强。

1.2.9 数据分析

采用Microsoft Excel 2013和Matlab进行绘图。数据分析采用SPSS 12.0进行显著性分析（显著性水平为p＜0.05或者p＜0.01）、本研究中所有的实验数据都进行了平行实验，游离氨基酸分布和GC-MS挥发性风味化合物分析平行测定2次，色差值、褐变程度、感官评定平行测定3次。

2 结果与讨论

2.1 水解度测定

图1 先加复合植物水解酶Viscozyme L后加碱性蛋白酶水解度

图2 先加碱性蛋白酶后加复合植物水解酶Viscozyme L水解度

由图1和图2可知，随着糖酶5%，10%，15%的不断增大，酶解液的水解度并无显著性增加，因此糖酶加入的多少并不影响水解度的大小。而碱性蛋白酶从5%增加到10%时，水解度有明显的增加，而从10%增加到15%时并无显著增加，可能是因为加入10%底物浓度的碱性蛋白酶时已将酶解液中的蛋白质基本水解成氨基酸，从而再加入更多的碱性蛋白酶效果并不显著。由图1和图2还可知，先加入碱性蛋白酶后加入糖酶的样品比先加入糖酶后加入碱性蛋白酶的样品有更好的水解度。

2.2 还原糖的测定

图3 先加复合植物水解酶Viscozyme L后加碱性蛋白酶还原糖含量

图4 先加碱性蛋白酶后加复合植物水解酶Viscozyme L还原糖含量

由图3和图4可知，碱性蛋白酶的加入对大豆粕酶解液还原糖含量并无显著性差异影响。而随着复合植物水解酶Viscozyme L 5%，10%，15%的不断增加，还原糖含量不断增加，复合植物水解酶Viscozyme L从5%到10%还原糖含量增加迅速，从10%增加到15%时的幅度不大，可见还原糖含量随糖酶增加的速率变缓。同时，由图3和图4还可知，先加入碱性蛋白酶后加入复合植物水解酶Viscozyme L的样品的还原糖含量要高于同样条件下先加入复合植物水解酶Viscozyme L后加入碱性蛋白酶的样品。

2.3 氨基氮含量测定

图5 先加复合植物水解酶Viscozyme L后加碱性蛋白酶氨基氮含量

图6 先加碱性蛋白酶后加复合植物水解酶Viscozyme L氨基氮含量

由图5和图6可知，增加复合植物水解酶Viscozyme L的加入量对氨基氮含量并无显著差异影响。而碱性蛋白酶对大豆粕酶解液氨基氮含量存在显著性差异。碱性蛋白酶从5%增加到10%时，氨基氮含量有明显的增加，而从10%增加到15%时增加不明显，和水解度基本保持一致。由图5和图6可知，先加入碱性蛋白酶后加入复合植物水解酶Viscozyme L的样品比先加入复合植物水解酶Viscozyme L后加入碱性蛋白酶的样品氨基氮含量更高。

2.4 游离氨基酸的测定

从检测出的17种氨基酸中挑选出相对含量较高的4种氨基酸，见表2。

表2 游离氨基酸含量测定表 mg／100 g

由表2可知，样品中的氨基酸含量随着碱性蛋白酶的增加而增多，且10%较5%增加明显，15%较10%氨基酸含量增加不明显。进一步验证了加入底物浓度10%的碱性蛋白酶时酶解液中的蛋白质可能已经被完全分解成氨基酸。因此，继续加入碱性蛋白酶氨基酸含量并没有显著的增加。其中先加入底物浓度10%的碱性蛋白酶后加入底物浓度15%的复合植物水解酶Viscozyme L的样品中游离氨基酸总量达到了最大值1433.14 mg／g，精氨酸382.93 mg／g，丙氨酸149.34 mg／g，谷氨酸160.13 mg／g，天冬氨酸97.91 mg／g均达到了最大值。

2.5 褐变程度测定

表3 褐变程度测定表

420 nm和294 nm处的吸光值越高，颜色越深。由表3可知，随着碱性蛋白酶和复合植物水解酶Viscozyme L的增加，吸光值随之增大。通过对数据分析发现，酶解液的水解度和还原糖浓度对其美拉德反应液褐变程度的影响都具有显著性。且相比较而言还原糖浓度对美拉德反应液褐变程度的影响更显著。同时，先加入碱性蛋白酶后加入复合植物水解酶Viscozyme L的样品比先加入复合植物水解酶Viscozyme L后加入碱性蛋白酶样品的褐变程度更深。先加入10%底物浓度的碱性蛋白酶后加入15%底物浓度的复合植物水解酶Viscozyme L的样品，420 nm处吸光值达到0.175，294 nm处吸光值达到0.246。

2.6 色差值测定

表4 样品色差值测定表

由表4可知，随着碱性蛋白酶和复合植物水解酶Viscozyme L的增多，美拉德反应液的总色差越大，样品颜色越暗，饱和度越大。通过对数据分析发现，酶解液中的还原糖浓度和水解度都对美拉德反应液的颜色具有显著性影响。且还原糖浓度对反应液颜色的显著性略微比水解度的显著性高。先加碱性蛋白酶后加复合植物水解酶Viscozyme L的样品略微比先加复合植物水解酶Viscozyme L后加碱性蛋白酶的样品的颜色深。先加入10%底物浓度的碱性蛋白酶后加入15%底物浓度糖酶样品的总色差值达到68.03836，饱和度达到56.255。反应液颜色相对不是很深，且比较饱和，同褐变程度测定的结果基本一致。

2.7 挥发性成分分析

表5 美拉德反应液挥发性化合物成分（mg／m L）

续 表

对美拉德反应液的香气成分进行分析，发现先加入10%底物浓度的碱性蛋白酶后加入15%底物浓度复合植物水解酶Viscozyme L的样品检测出来的香气成分最多且含量相对较高。共检测出37种香气成分，其中4种烃类化合物（2.3%）、7种醇类化合物（20.63%）、6种酯类化合物（15.66%）、3种醛类化合物（8.61%）、5种酮类化合物（7.25%）、5种芳香族类化合物（6.03%）、1种吡嗪类化合物（1.42%）、2种呋喃类化合物（1.1%）、2种吡啶类化合物（1.15%）和2种腈类化合物（1.16%）。酯类物质对酶解液整体的风味具有重要的协调作用，赋予酶解液更有层次的香气。醛类化合物是氨基酸和糖类物质strecker降解后产生的斯特雷克尔醛，经由转胺、脱羧基反应产生的。另外，呋喃、吡嗪类化合物通常具有强烈的肉香风味和烧烤风味。

2.8 感官评定

感官评定是在各感官评定员无显著性差异的基础上进行的，将18个样品进行了感官评定，然后选取了其中7种感官评定较好的样品，具体结果见图7。

图7 7种样品的感官评定结果

由图7感官评定结果可知，随着复合植物水解酶Viscozyme L的不断增加，酶解液中的还原糖含量不断增加，导致美拉德反应液的焦甜味也随之提升。同时，酶解液中的游离氨基酸越多，美拉德反应液的醇厚感和持续性也更好。综合各因素，感官评定员对先加入10%底物浓度的碱性蛋白酶后加入15%底物浓度的复合植物水解酶Viscozyme L的样品有最高的评价。其表现出了更强的鲜味、肉香味，虽然其持续性和醇厚感并不突出，但它的苦味明显弱于其他样品，拥有较好的呈味效果。因此综合考虑，先加入10%底物浓度的碱性蛋白酶后加入15%底物浓度的复合植物水解酶Viscozyme L样品的感官评价要优于其他样品。

3 结论

实验通过对大豆粕酶解液的水解度、还原糖含量、氨基氮含量、游离氨基酸含量等指标的测定，确定了大豆粕的最佳酶解顺序，即先加入10%底物浓度的碱性蛋白酶后加入15%底物浓度的复合植物水解酶Viscozyme L，此时酶解效果最佳，水解度为11.64%，还原糖含量为0.674 mg／mL，氨基氮含量为1.553 mg／mL，游离氨基酸总量达到1433.14 mg／g，其中精氨酸382.93 mg／g，丙氨酸149.34 mg／g，谷氨酸160.13 mg／g，天冬氨酸97.91 mg／g，均达到了最高值。

通过GC-MS法对美拉德反应产物进行香气成分分析，其中先加入10%底物浓度的碱性蛋白酶后加入15%底物浓度的复合植物水解酶Viscozyme L样品的香气成分更为丰富，共检测出37种香气成分，其中醛类、醇类、酮类、呋喃类、吡啶类等对产物的肉香味生成具有重要的作用。同时样品的总色差值达到68.03836，饱和度达到56.255，其在420 nm处吸光值达到0.175，在294 nm处吸光值达到0.246。通过对各样品进行感官评定分析，同样先加入10%底物浓度的碱性蛋白酶后加入15%底物浓度的复合植物水解酶Viscozyme L的样品得到了最好的感官评价，其肉香味和鲜味更为突出。

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Research on Savory Flavoring Prepared by Maillard Reaction Based on Soybean Meal Hydrolysate

ZHENG Jia-lun，LI Chen，LU Li-xia，XIONG Xiao-hui
（College of Food Science and Light Industry，Nanjing Tech University，Nanjing 201611，China）

The soybean meal is used as raw material to prepare savory flavoring by enzymolysis and Maillard reaction.The effects of alkaline protease and complex photolytic enzyme Viscozyme L on the property of enzymatic hydrolysate are investigated.The amino acid composition and aroma components of the product are analyzed by HPLC and GC-MS.The results show that the enzymolysis efficiency of Viscozyme L is the best when the concentration of alkaline protease is 10%and the concentration of substrate is 15%.The hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate is 11.64%，the content of reducing sugar is 0.674 mg／m L，the content of amino nitrogen is 1.553 mg／m L，and the total amount of free amino acid is 1433.14 mg／g.Volatile compounds such as decanal，2-decanone and 2-hexylfuran are detected from Maillard reaction liquid，and they have an important effect on meat flavor formation.

soybean meal；enzymatic hydrolysate；Maillard reaction

TS264.3

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.002

1000-9973（2017）10-0004-07

2017－04－15

江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20150950）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31501529）

郑家伦（1992－），男，硕士，研究方向：咸味香精。