超临界CO2萃取-气相色谱法测定膨化食品中反式脂肪酸

周永生， 顾 浩

(常州大学石油化工学院,江苏常州 213164)

反式脂肪酸(TFAs)是一类含有一个或多个碳碳双键构型的不饱和脂肪酸。有报道指出，过量摄入TFAs易增加患脑血管疾病、冠心病、糖尿病和乳腺癌等的风险[1]。膨化食品具有食用方便、易于消化、香酥可口、经济实惠等特点，深受消费者的青睐，尤其是少年儿童更喜欢食用[2]。膨化加工的加热、加压过程在使原料膨胀的同时也易导致脂肪酸变性生成TFAs。在检测固体食品中TFAs之前，须对样品进行TFAs提取和甲酯化衍生。传统的食品中TFAs的提取方法有微波辅助溶剂萃取[3 - 5]、超声辅助溶剂萃取[6]、索氏提取[7]和固相萃取[8]等，这些方法均使用有毒有害的有机溶剂。微波萃取和超声萃取均易导致样品局部过热，索氏提取须对溶有提取物的溶剂进行加热蒸馏，而脂肪酸受热后易发生氧化变质[9]或空间构型的转变[10]。而超临界CO2(SC-CO2)萃取具有简单、方便、萃取效率高的优点，且CO2无毒无味、价廉易得不易燃[11]。此外，超临界CO2萃取法较低的操作温度能有效防止脂肪酸变性[12 - 13]，因此常被用于提取植物种子中的油脂[14 - 16]。由于超临界CO2流体在膨化食品内的传质阻力远小于植物种子，因此超临界CO2萃取法更适用于对膨化食品中脂肪酸的提取。

本研究采用超临界CO2萃取法提取膨化食品中的脂肪酸，对提取物采用KOH-甲醇法衍生化处理，再用经典的气相色谱法[17]检测其中反式脂肪酸含量。该方法与国家标准(GB/T 22110-2008)《食品中反式脂肪酸的测定 气相色谱法》中采用的溶剂提取法相比，超临界CO2萃取法方便快捷、提取率高且对人体和环境无任何危害。本方法准确可靠、回收率高，可为相关部门制定或修改相应的规范标准等提供依据和参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与材料

GC-2010 Plus型气相色谱仪(日本，岛津公司)；SFT-100型超临界萃取仪(美国，SFT公司)；AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

反-10-十八烯酸、反-10-十八烯酸甲酯、十三烷酸甲酯等标准品纯度均≥99%，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；甲醇和正己烷均为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司；KOH、NaCl和无水Na2SO4均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

薯片、面包、饼干和爆米花等均购自当地超市。

1.2 标准溶液配制

准确称取0.0306 g十三烷酸甲酯于50 mL容量瓶中，用正己烷定容后摇匀作为内标液。称取0.0399 g反-10-十八烯酸甲酯于250 mL容量瓶中，并用正己烷定容后摇匀，作为标准储备液。移取1、5、10、15、25 mL标准储备液分别加入5只50 mL容量瓶中，再各移取2 mL内标液加入容量瓶中，用正己烷定容后摇匀，得到浓度依次为0.7980、3.9900、7.9800、11.9700和19.9500 mg/L的标准系列溶液。

1.3 脂肪酸提取及衍生化

称取约6 g样品，粉碎后装入柱状滤纸袋，封口后放入萃取釜；打开排气阀和液态CO2钢瓶总阀，将萃取釜中的空气置换后关闭排气阀；分别接通萃取釜和CO2泵电源，设定萃取温度、萃取压力和液态CO2流量，待釜温及萃取压力达到设定值后缓慢打开排气阀，待气体流量稳定后开始动态萃取。产物收集在干净的小瓶中，萃取一定时间后结束实验，精密称量提取物。

称取约0.2 g脂肪酸于5 mL 具塞试管中，加入2 mL正己烷，摇匀后再加入2 mL一定浓度的 KOH-甲醇溶液，将试管放入超声波清洗器中，设定水温和超声时间。当温度达到设定值后开始超声，达到预定时间后自动停止，取出试管后静置，待溶液澄清后加入2 mL饱和NaCl溶液，将上层清液移入50 mL容量瓶中，加入2 mL内标液，用正己烷定容后摇匀，待测。

1.4 色谱分析条件

DB-225ms毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：250 ℃；柱温程序：初始温度100 ℃，保留1 min后以3 ℃/min升至240 ℃，保留30 min；火焰离子化检测器(FID)；检测器温度：250 ℃；氢气流量：100 mL/min；空气流量：300 mL/min；载气：高纯氮气，流速为50 mL/min；分流进样，分流比：50；进样量：0.6 μL。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件优化

以萃取压力(A)、萃取温度(B)、萃取时间(C)、CO2流量(D)四个因素，以脂肪酸提取率(提取物与样品的质量比)为考察指标来设计正交试验。因素水平见表1，试验结果见表2。由表2可见，各因素对试验结果的影响顺序依次为：A >B >C >D，最佳组合条件为A2B2C3D2，即萃取压力30 MPa、萃取温度45 ℃、萃取时间2.0 h、CO2流量15 mL/min。在最佳组合条件下进行验证试验，脂肪酸提取率为18.52%。采用国家标准(GB/T 22110-2008)《食品中反式脂肪酸的测定 气相色谱法》中规定的提取方法，脂肪酸提取率为18.01%。很显然，超临界CO2提取效果优于溶剂提取法。

表1 SC-CO2萃取因素与水平

表2 SC-CO2萃取正交试验设计与结果

(续表2)

No.ABCDExtraction rate(%)3133315.954212317.395223117.926231216.967313217.218321316.819332116.06k115.8816.6516.3816.45k217.4217.0216.5916.83k311.6916.3217.0316.72R5.730.700.440.38

2.2 甲酯化条件优化

以反-10-十八碳烯酸(C18∶1-10t)为原料，采用KOH-甲醇法对其进行甲酯化衍生，以C18∶1-10t甲酯的转化率为考察指标。以KOH-甲醇浓度(A)、反应时间(B)、反应温度(C)三个因素设计正交试验，因素水平见表3，试验结果见表4。由表4可见，各因素对试验结果的影响顺序依次为：A > C > B，最佳组合条件为A1B1C1，即KOH-甲醇浓度1 mol/L、超声时间1 min、甲酯化温度20 ℃。在该条件下C18∶1-10t甲酯的转化率为99.2%。

表3 甲酯化因素与水平

表4 甲酯化正交试验设计与结果

图1 提取物的色谱图Fig.1 Chromatogram of extract by methyl esterification1:Lauric acid methyl ester.2:Glycyl alcohol.3:Tetradecanoic acid methyl ester.4:Pentadecanoic acid methyl ester.5:Hexadecanoic acid methyl ester.6:Palmitoleic acid methyl ester.7:trans10-Octadecenoic acid methyl ester.8:Octadecanoic acid methyl ester.9:cis9-Octadecenoic acid methyl ester.10:cis9,cis12-Octadecadienoic acid methyl ester.11:cis9,cis12,cis15-Octadecatrienoic acid methyl ester.12:Eicosanoic acid methyl ester.13:2-hexyl-Cyclopropaneoctanoic acid methyl ester.

2.3 提取物组成分析

采用气相色谱法对薯片提取物甲酯化产物进行定性分析，确定其中的反式脂肪酸类型。由图1可见，13种提取物中只有一种反式脂肪酸，为C18∶1-10t，这与文献报道[18]的结果一致。

2.4 线性关系和定量限

在1.4节GC-FID检测条件下，对1.2节配制的5个标准溶液上机检测，每个样品连续进样5次，计算C18∶1-10t与内标物峰面积的平均值。以C18∶1-10t与内标物的峰面积比(A反/A内)对C18∶1-10t与内标物的浓度比(c反/c内)作图并线性拟合，得到标准工作曲线见图2。线性方程为：y=0.0179+0.7211x，相关系数R2=0.9997。称取0.1016 g C18∶1-10t甲酯加入100 mL容量瓶，正己烷定容后上机检测，所得GC峰信噪比(S/N)远高于10。对该溶液逐级稀释，当浓度降至1.016×10-3mg/L时，C18∶1-10t甲酯GC峰的S/N约为10，故本方法的定量限约为0.001 mg/L。

2.5 加标回收率

向三个25 mL容量瓶中分别加入5 mL浓度为0.5030 mg/L的C18∶1-10t溶液，再分别加入5 mL浓度分别为0.1016 mg/L、1.1971 mg/L和10.0378 mg/L的C18∶1-10t溶液，再向每个容量瓶中各加入2 mL内标液，用正己烷定容后上机测定。三个不同加标浓度样品的测定浓度依次为0.1195 mg/L、0.3391 mg/L、2.2410 mg/L。根据测定浓度计算C18∶1-10t总量，减去加标前容量瓶中原有的C18∶1-10t量，将差值除以加入的C18∶1-10t量，即得到回收率依次为95.8%、99.6%和106.6%。

2.6 日内和日间的相对标准偏差

在1.4节GC-FID条件下，对配制好的待测样品在一天内连续检测7次，根据线性方程计算样品中C18∶1-10t含量，计算日内相对标准偏差(RSD)。在相同的仪器条件下，每天对待测样品检测一次，连续7 d，根据线性方程计算样品中C18∶1-10t含量，计算日间RSD。结果显示采用该方法检测C18∶1-10t甲酯时，日内RSD为7.5%，日间RSD为8.5%，精密度良好。

2.7 样品测定

采用建立的方法对购自超市的薯片、面包、饼干和爆米花等膨化食品进行检测。按上述选定的实验方法进行反式脂肪酸提取和甲酯化。检测结果显示，薯片中C18∶1-10t含量为64g/g，面包、饼干和爆米花中均未检出反式脂肪酸。

3 结论

本文建立了超临界CO2萃取-气相色谱法测定膨化食品中反式脂肪酸的分析方法，采用正交试验设计法对反式脂肪酸提取和甲酯化条件进行了优化。在萃取压力30 MPa、萃取温度45 ℃、萃取时间2.0 h、CO2流量15 mL/min条件下进行萃取，脂肪酸提取率为18.52%。该方法快速、准确、提取率高，且对人体和环境无任何危害，具有较好的实用价值。