畜禽粪便中磺胺类抗生素及其N4-乙酰代谢物残留特征的分析

何思远， 王德全， 宋伟明， 刘万毅， 孟 哲*

(1.宁夏大学土木与水利工程学院，宁夏银川 750021；2.宁夏大学化学化工学院，宁夏银川 750021)

规模化畜禽养殖中大量使用喹诺酮类、四环素类和磺胺类等各种抗生素，使得原本作为有机肥料而大量施用于农业生产的畜禽粪便资源，有可能转变为破坏环境的污染物[1 - 2]。农田长期施用不经任何处理并残留有抗生素的粪便，将造成土壤抗生素残留污染[3]，也可能被作物吸收累积而危及农产品安全[4]。磺胺类(Sulfonamides,SAs)抗生素由于普适及廉价，长期大量用于动物疾病的防治和治疗以促进畜禽生长。研究表明[5]，只有少量抗生素参与动物的新陈代谢而被有效利用，大部分抗生素携带抗性基因(ARGs)以原药、非代谢物形式或活性代谢物被排泄，因此，在动物粪便中很可能有含量较高的抗生素及其活性代谢产物。

目前，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术已经成为检测动物源性食品中抗生素多残留的主要手段，动物源性食品中相关磺胺类及其乙酰代谢物残留的测定已有报道[6 - 7]。在畜禽粪便中各类抗生素残留的报道中[8 - 9]，磺胺类抗生素的检出率和残留量较低，而相关N4-乙酰磺胺类代谢产物残留的检测未见报道。本研究建立了加速溶剂萃取-超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)快速、有效地确认及基质匹配定量分析方法，用于监测实际畜禽养殖场猪粪、鸡粪和牛粪中磺胺类及其代谢物的残留，为粪肥安全施用和土壤污染的控制提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ASETM350加速溶剂萃取仪(美国，ThermoFisher公司)；Oasis HLB 固相萃取柱(3 mL/60mg，Waters公司)；H2100R台式高速冷冻离心机、旋转蒸发仪、涡旋振荡器、氮吹仪等处理样品。Xevo TQ超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国，Waters 公司)。

磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲嘧啶(Sulfamerazine，SMR)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，SMZ)、磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole，SMX)、N4-乙酰磺胺嘧啶(N4-Acetylsulfadiazine，N4-ASDZ)、N4-乙酰磺胺甲嘧啶(N4-Acetylsulfamerazine，N4-ASMR)、N4-乙酰磺胺二甲嘧啶(N4-Acetylsulfamethazine，N4-ASMZ)和N4-乙酰磺胺甲恶唑(N4-Acetylsulfamethoxazole，N4-ASMX)，均购自德国Ehrenstorfer GmbH公司，纯度均大于98%。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，购自迪马公司(北京)；正己烷、三氯乙酸等其它试剂均为分析纯。分别配制8种磺胺类及其代谢产物的标准品单标甲醇储备液(100 mg/L)和混合标准品甲醇储备液(含2.5 mg/L的磺胺类和25 mg/L的乙酰代谢物)，贮存于洁净棕色玻璃瓶内，-18 ℃冷藏。实验用水为超纯水。

1.2 样品采集及预处理

样品采集于吴忠市周边的4个生猪养殖基地、4个肉鸡养殖基地和4个奶牛养殖基地的畜禽粪便，分多点取样各500 g后，混合。采集的样品在实验室通风处阴干，混匀后、按四分法取样200 g，研磨，过60目筛，置于-18 ℃冰柜存放。准确称取4 g(±0.1 g)经研磨的畜禽粪便样品，加入硅藻土(3～4 g)混合均匀，装入22 mL的萃取池。优化的实验条件为：萃取压力10 MPa、加热温度120 ℃、加热时间6 min，静态萃取时间5 min；淋洗体积40%、吹扫时间60 s；周期2次；用20%乙腈-5%三氯乙酸(100∶1，V/V)萃取溶剂进行加速全自动提取。提取剂约40 mL于萃取瓶中，加10 mL正己烷除脂(连续 3次)后旋转蒸发至近5 mL，转移至10 mL离心管，低温高速离心(6 ℃、10 000 r/min)，上层清液转移至已经活化的Oasis HLB小柱净化、纯水淋洗、0.1%甲酸的甲醇溶液洗脱，洗脱液氮吹至近干，50%甲醇溶液溶解，过0.22 μm微孔滤膜，转移至自动进样瓶，待UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS分析

UPLC条件：采用Waters Acquity UPLC 色谱仪和 BEH C18色谱柱(50×2.1 mm，1.7 μm)进行分析。流动相A为0.1%甲酸的甲醇溶液，流动相B为0.1%甲酸水溶液；流速0.4 mL/min。梯度洗脱程序：0～3 min，初始流动相A由10%线性增加到45%；3～4 min，流动相A增至95%；4～4.1 min，流动相A为100%；4.1～5.1 min，流动相A降为10%并保持2 min，共运行7 min。柱温40 ℃，样品池温度10 ℃，进样量5 μL。

MS/MS条件：采用三重四极杆串联质谱仪(Waters Xevo TQ)，使用电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)。离子源温度150 ℃，毛细管电压3.0 kV，脱溶剂温度450 ℃，脱溶剂气流量(氮气)850 L/h，碰撞气氩气0.16 mL/min。采用多离子反应监测模式(MRM)扫描，优化后的8种磺胺类及其代谢产物的质谱参数见表1。

表1 8种磺胺类及其代谢物的保留时间和优化的MS/MS质谱参数

a:Transition=precursor ion→product ion;b:Collision energy.

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

图1 8种目标物混合标准溶液(50 μg/L)总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms for 8 analytes at 50 μg/L each in solvent a.SDZ;b.SMR;c.N4-ASDZ;d.SMZ;e.N4-ASMR;f.SMX;g.N4-ASMZ;h.N4-ASMX.

实验以0.1%甲酸甲醇溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)作为流动相，在1.3优化条件下，8种目标分析物可在3 min内获得很好的分离。8种目标分析物混合标准溶液(50 μg/L)的总离子流色谱图如图1。考虑到基质效应的影响，实验采用基质匹配混合标准溶液既能有效地减少基质效应的影响，又能改善由于基质带来的分析误差。

2.2 加速溶剂萃取-固相萃取柱净化条件选择

畜禽粪便样品中目标分析物的提取采用加速溶剂萃取，实验选择了20%乙腈、50%乙腈、20%乙腈-5%三氯乙酸(100∶1,V/V)和20%乙腈-10%三氯乙酸(100∶1,V/V)4种提取溶剂，分别对 8种磺胺类及其代谢产物进行提取。对比4种不同提取剂对 8种目标化合物提取效率的影响，以20%乙腈为提取剂，回收率在40%～65%之间，高于以50%乙腈为提取剂，但远低于以20%乙腈-5%三氯乙酸(100∶1,V/V)为提取剂的提取率78%～96%。实验表明三氯乙酸的添加有利于目标物的提取，但以20%乙腈-10%三氯乙酸(100∶1,V/V)提取对8种目标物的提取率在55%～84%之间，其中N4-乙酰磺胺嘧啶和N4-乙酰磺胺甲恶唑的回收率低于60%。综合考虑，选择20%乙腈-5%三氯乙酸(100∶1,V/V)作为提取溶剂，对目标物的提取率在78%～96%之间，相对标准偏差(RSD)均小于20%。

2.3 方法的分析性能

在优化的色谱-质谱条件下进行测定，以定量离子对的峰面积计算样品中相应待测物的含量。配制基质匹配混合标准工作液，建立目标化合物的基质匹配标准曲线的线性回归方程见表2。4种磺胺类及相应的4种代谢物分别在1.0～200 μg/L和20.0～2 000 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数r2大于0.9921，可以满足定量分析的要求。根据1.0 μg/L(含20.0 μg/L的代谢物)基质匹配混合标准工作液色谱峰，以定量离子对3倍信噪比(S/N=3)的响应值计算方法检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)的响应值计算方法定量限(LOQ)见表2，磺胺类检出限为0.5 μg/kg低于磺胺类代谢物的检出限5 μg/kg。

实验分别考察了空白样品加标水平在10、50和100 μg/kg下，8种磺胺类及其代谢产物的回收率，每个加标浓度平行测定5次，采用基质匹配外标法进行定量计算得到平均回收率如表2。在3个添加水平分析物的平均回收率(63.8%～103.7%)在职业分析化学协会(AOAC)提出的允许范围之内，日内RSD在9%以下，日间RSD在13%以下，说明该方法准确度高，且重现性良好。

表2 8种目标分析物的线性范围、线性方程、检出限、加标回收率与相对标准偏差

2.4 实际样品的测定

采用本文建立的加速溶剂萃取-UPLC-MS/MS分析方法，依据欧洲共同体委员会制定2002/657/EC决议[10]，对鸡粪、猪粪和牛粪样品中阳性样品进行确认。阳性样品中可疑目标化合物(磺胺类及其代谢物)均满足：(1)样品中目标物的保留时间与基质匹配校准溶液的保留时间误差均小于±0.05 min，低于允许误差±2.5%；(2)选择多反应监测模式(MRM)，每一对诊断离子的信噪比(S/N)都大于3；(3)对96/23/EC指令附录Ⅰ的B组物质(包括磺胺类)的确认需要最少3个识别点，在实际样品中确认目标化合物的识别点包括母离子(1.0个识别点)、2个MRM特征离子(3.0个识别点)。

基于该方法建立的基质匹配定量曲线，对阳性粪便样品中已被确认的目标化合物进行计算。由测定结果表明，在鸡粪、猪粪和牛粪样品中均检测到多种磺胺类抗生素及其N4-乙酰磺胺代谢物见图2。其中磺胺二甲嘧啶和磺胺甲恶唑的检出率和残留量较高，检出率为90%，残留量的平均值范围12～34 μg/kg高于相关文献报道[8 - 9]的残留量范围0～20 μg/kg。磺胺代谢物中，乙酰代谢物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶和N4-乙酰磺胺甲恶唑的检出率高达100%，平均残留量在鸡粪中为58.1～79.1 μg/kg，猪粪中为80.5～104.2 μg/kg，牛粪中为38.3～50.2 μg/kg。在所有畜禽粪便样品中未能检测到N4-乙酰磺胺嘧啶(未被发现或含量低于方法定量限)。

2.5 畜禽粪便中磺胺类抗生素及其N4-乙酰代谢物残留特征的分析

图2 磺胺类抗生素及其N4-乙酰代谢物残留的含量分布Fig.2 Distribution of sulfonamides antibiotics and their N4- acetylizad metabolites in animal feces

通过对4个生猪养殖基地、肉鸡养殖基地和奶牛养殖基地实际畜禽粪便样品的分析，大部分的畜禽粪便样品中可同时检测出2种以上磺胺类化合物和N4-乙酰磺胺代谢产物，尤其是N4-乙酰磺胺二甲嘧啶和N4-乙酰磺胺甲恶唑的检测残留量较高。在畜禽粪便中相关乙酰磺胺代谢产物测定的数据还很少有报道，但高浓度、多种类乙酰磺胺类代谢物残留量的监测，暗示了畜禽养殖场存在过度使用磺胺类抗生素混合制剂的可能性。

不同畜禽粪便样品中磺胺类抗生素及其代谢物的残留量的差异较大(图2)，其中猪粪>鸡粪>牛粪。猪粪中N4-乙酰磺胺代谢物含量高达154.1 μg/kg，鸡粪中为97.4 μg/kg，牛粪为65.2 μg/kg，其总残留量在180.1～384.8 μg/kg范围。尤其在猪粪和鸡粪样品中，磺胺二甲嘧啶和磺胺甲恶唑的平均残留量范围为16.8～34.5 μg/kg和12.0～29.6 μg/kg，而N4-乙酰磺胺二甲嘧啶和N4-乙酰磺胺甲恶唑平均残留量范围为80.5～104.2 μg/kg和58.1～79.1 μg/kg。乙酰磺胺类代谢产物的残留特征表现为：乙酰磺胺类代谢物的残留量基本是相应母体磺胺类抗生素残留量的2倍。表明乙酰磺胺代谢物是磺胺类抗生素经动物排泄、且具有活性的、稳定的最终产物，从而解释了很多文献报道磺胺类残留值很低的原因，也证实了在动物粪便中存在含量较高的活性代谢产物。

3 结论

按本文建立的方法，可实现畜禽粪便(鸡粪、猪粪和牛粪)样品中多个磺胺类抗生素及其代谢物的测定。基于该方法探讨了鸡粪、猪粪和牛粪样品中磺胺类及其N4-乙酰代谢产物残留量的污染特征。实验结果表明，该方法灵敏度高、准确度好、定性可靠、能满足实际样品中磺胺类抗生素和N4-乙酰代谢物的测定，具有较高的实用价值。