固相萃取-超高效液相色谱-同位素稀释串联质谱法测定蜂蜜中的甲硝唑和氯霉素

2017-10-17屠瑞莹吴国华

分析科学学报 2017年1期

刘伟，张楠，李兵，范赛，屠瑞莹，吴国华，薛颖，赵榕*

(北京市预防医学研究中心，北京 100013)

甲硝唑(Metronidazole，MNZ)属于硝基咪唑类抗生素，其抗菌广谱，对厌氧原生动物和细菌十分有效。研究表明，硝基咪唑类药物及其代谢产物具有潜在的动物致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性[1 - 2]。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)属于酰氨醇类药物，曾被广泛地用于动物各种传染性疾病的预防和治疗。氯霉素对人体有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症等疾病[3 - 4]。甲硝唑和氯霉素早在2002年就被农业部列入禁止用于包括蜜蜂在内的所有食用动物的物质名单中，且不得在动物源食品中检出[5]。然而，在养蜂过程中，蜂场为避免蜂群感染某些疾病，可能会违规使用这些便宜且治疗指数较高的抗生素。蜂蜜中检出甲硝唑或氯霉素的案例时有发生[6]。

目前，关于蜂蜜中甲硝唑或氯霉素的检测主要采用液相色谱-串联质谱法[7 - 8]；样品前处理方法主要采用溶剂直接提取[9]、QuEChERS方法[10]或固相萃取法[11 - 12]。由于甲硝唑与氯霉素的化学结构和理化性质有较大差异，在采用串联质谱作为检测器时，需要分别采用正离子和负离子采集模式，因此同时测定甲硝唑和氯霉素的方法报道不多。本文报道的方法可以采用一种前处理过程同时对蜂蜜样品中残留的甲硝唑和氯霉素进行提取、富集和净化，并且通过串联质谱的正负离子切换模式达到甲硝唑和氯霉素的同时测定，提高了检测效率，降低了检测成本。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters Xevo TQ-S超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国，Waters 公司)；高速冷冻离心机(德国，SIGMA公司)；氮气吹干仪(美国，Orgnomation公司)；固相萃取装置(日本，SHIMADZU-GL公司)；InertSep RP-1固相萃取柱(日本，SHIMADZU-GL公司)。

甲硝唑、甲硝唑内标物(Metronidazole-d4，MNZ-d4)，氯霉素和氯霉素内标物(Chloramphenicol-d5，CAP-d5)，均购自 Dr.Ehrenstorfer，纯度 ≥ 99%。乙酸乙酯、甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯(美国Dikma公司)；实验用水由Milli-Q系统(美国，Millipore公司)制得。

1.2 样品前处理

1.2.1提取称取2 g蜂蜜样品(精确至0.01 g)于50 mL具塞塑料离心管中，加入50 μL浓度为10 ng/mL的混合内标液。向离心管内加入5 mL超纯水，待蜂蜜完全溶解后再加入20 mL乙酸乙酯，涡旋混匀1 min再置于摇床上振荡20 min。之后，将离心管置于高速冷冻离心机中，以10 000 r/min离心5 min，再将上层乙酸乙酯转移至另一50 mL离心管中，在40 ℃的水浴中氮气吹干。然后，向离心管中加入10 mL水并涡旋混匀，待固相萃取净化。

1.2.2净化InertSep RP-1固相萃取柱预先用5 mL甲醇和5 mL水进行活化与平衡。将10 mL样品溶液分批倒入固相萃取小柱中；待溶液全部通过小柱后，用5 mL含10%甲醇水溶液淋洗小柱。再通过减压抽干小柱中的水分，采用5 mL含70%甲醇水溶液洗脱目标物。洗脱液在40 ℃的水浴中用氮气吹至近干，加入1 mL定容液(流动相初始比例)，过0.22 μm滤膜，供仪器测定。

1.3 仪器条件

1.3.1色谱条件色谱柱:Endeavorsil C18柱(100×2.1 mm，1.8 μm，美国Dikma公司)；流动相：A为水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～3 min，5%～95%B；3～5 min，95%B；5～7 min，95%～5%B；7～8 min，5%B；流动相流速：0.25 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL。

1.3.2质谱条件电喷雾离子源(ESI)；甲硝唑为正离子模式(ESI+)，氯霉素为负离子模式(ESI-)；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：2.5 V；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；扫描方式：多反应监测模式(MRM)。其他质谱参数见表1。

表1 甲硝唑与氯霉素的质谱参数与保留时间

*Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

在串联质谱上进行正负离子采集模式切换时，系统通常需要一定的时间来达到稳定状态。为了使目标物均在系统稳定时得到采集，两个目标物应有适当的分离度。实验比较了4种不同的流动相组合：(1)水+甲醇；(2)水+乙腈；(3)0.1%甲酸水溶液+甲醇；(4)0.1%甲酸水溶液+乙腈。通过对梯度洗脱程序进行适当调整，确定了采用水与乙腈组成二元流动相体系。在此条件下，目标物在质谱上的响应值(峰面积)较高，两个组分的峰形和分离度较好。通过多次进样(n>6)计算峰面积的相对标准偏差表明，采集目标物时系统处于稳定状态。

2.2 前处理方法的优化

针对蜂蜜样品和目标物的性质，本实验比较了4种不同的前处理方式，包括：(1)采用水直接溶解蜂蜜，再将蜂蜜水溶液进行固相萃取净化；(2)加水溶解蜂蜜后，加入乙酸乙酯萃取目标物，取乙酸乙酯层并将溶剂吹干后加入超纯水溶解残渣，再进行固相萃取净化；(3)采用pH=8.8的磷酸缓冲液溶解蜂蜜，再将样品溶液进行固相萃取净化；(4)采用QuEChERS前处理方法，用乙腈提取目标物，取部分乙腈层吹干溶剂后定容、过膜，上机测定。通过加标回收实验比较回收率表明，采用方法(2)的回收率明显高于其他3种方式，故对蜂蜜试样采用方法(2)前处理方式。

为达到较好的净化效果，本实验前处理采用固相萃取技术对两种目标物进行同时富集和净化。参考文献确定采用反相机理的固相萃取柱。根据目标物的理化性质，对固相萃取的淋洗和洗脱曲线进行了考察，确定了采用含10%甲醇水溶液作为淋洗液，去除在萃取柱上极性较强、保留相对较弱的杂质；采用含70%甲醇水溶液作为洗脱液以避免有更多极性相对较弱的杂质被洗脱下来。淋洗曲线和洗脱曲线见图1与图2。

图1 固相萃取淋洗曲线Fig.1 The relationship between rinse solution and recoveries of metronidazole and chloramphenicol

图2 固相萃取洗脱曲线Fig.2 The relationship between elute solution and recoveries of metronidazole and chloramphenicol

2.3 方法学评价

以目标物的质量浓度为横坐标，以目标物和内标物的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线得到线性方程。结果表明，甲硝唑和氯霉素在1～100 ng/mL范围内，在选定的色谱和质谱条件下进行测定时，线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.999。取阴性蜂蜜样品进行3个浓度水平(0.5、5和25 μg/kg)的加标回收实验，每个添加水平重复6次。由表2可见，目标物的回收率范围为71.4%～122.4%，相对标准偏差(RSD)范围为 5.0%～12.3%，表明本方法的准确度和精密度均满足分析要求。方法检出限和定量限见表2。