α1-酸性糖蛋白与奶牛隐性乳房炎的相关性分析

2017-10-17蒋磊

中国奶牛 2017年9期

关键词：糖蛋白乳清酸性

蒋磊

（辽宁省畜牧业经济管理站，沈阳 110032）

α1-酸性糖蛋白与奶牛隐性乳房炎的相关性分析

蒋磊

（辽宁省畜牧业经济管理站，沈阳 110032）

为了分析奶牛隐性乳房炎的不同发病阶段与乳清中α1-酸性糖蛋白含量变化之间的关系，本试验选取10头健康奶牛和30头不同发病程度（轻、中、重）隐性乳房炎患牛作为试验动物，采用α1-酸性糖蛋白ELISA检测试剂盒测定各组乳清样品中α1-酸性糖蛋白的含量，对α1-酸性糖蛋白与奶牛隐性乳房炎的相关性进行分析。结果显示，隐性乳房炎组奶牛乳清中α1-酸性糖蛋白的含量显著或极显著高于健康组奶牛（P＜0．01或P＜0．05），且随着奶牛隐性乳房炎病情的加重及乳中体细胞数的增加，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈现出递增趋势。研究结果提示，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量变化与奶牛隐性乳房炎的发病程度具有一定的相关性，乳腺炎症引发的乳腺损伤及乳中体细胞数增加与乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈正相关。

奶牛；隐性乳房炎；乳清；α1-酸性糖蛋白

我国约70%的奶牛乳房炎为隐性乳房炎，主要是由物理、化学或微生物感染等多种病因引起的乳房炎症，虽然患牛的乳腺组织发生了病理学变化，乳汁理化性质也发生了改变，但用手触诊乳腺或肉眼检查乳汁时则难以发现异常[1]。隐性乳房炎是奶牛最多发、最常见、造成奶牛业经济损失最为严重的顽固性疾病之一，不但影响奶牛的产奶量及奶品质，而且还增加乳汁携带病原微生物的危险性，危害人类健康[2]。随着我国奶牛业及乳品工业的进一步发展，奶牛隐性乳房炎的诊断与治疗也得到了人们的高度重视。

α1-酸性糖蛋白（α1-Acid glycoprotein，α1-AGP）又称类黏蛋白，主要由肝脏合成。α1-AGP的肽链结构与结合珠蛋白α链结构类似，是目前研究最广泛的血清急性期蛋白之一[3]。α1-AGP的表达受到多种细胞因子、激素等的调控，在各种炎症、组织损伤、肿瘤等一系列疾病发生时，其浆液中含量升高，尤其在微生物感染引起的炎症中α1-AGP表达量的变化更为明显,常被作为炎症发生时的判断指标[4]。Bian等[5]在奶牛隐性乳房炎乳清蛋白质组学分析中发现隐性乳房炎发生时乳清中α1-酸性糖蛋白的含量显著升高，此研究为寻找隐性乳房炎新的分子诊断标志物奠定了理论基础。本试验拟研究乳清中α1-AGP的含量与奶牛隐性乳房炎不同发病阶段之间的关系，旨在为隐性乳房炎快速诊断试剂盒的研发提供新的思路和参考。

1 材料与方法

1．1 试验动物

在辽宁沈阳某奶牛场选择正常泌乳且无临床型乳房炎症状的奶牛，采用乳汁体细胞计数（SCC）与加州乳房炎检测法（CMT）进行健康奶牛和隐性乳房炎患牛的鉴定与筛选。SCC＜10万个/mL且CMT结果为阴性的奶牛为健康对照组；50万个/mL＜SCC＜100万个/mL且CMT结果呈弱阳性的奶牛为轻度隐性乳房炎组；150万个/mL＜SCC＜200万个/mL且CMT结果呈阳性的奶牛为中度隐性乳房炎组；SCC＞300万个/mL且CMT结果呈阳性的奶牛为重度隐性乳房炎组。最终根据胎次、年龄、泌乳期、产奶量等指标相近的原则，选择健康奶牛10头和不同发病阶段的隐性乳房炎患牛30头，其中轻度、中度、重度隐性乳房炎患牛各10头。

1．2 主要仪器与试剂

Varioskan酶标仪（Thermo 公司，美国）；低温高速台式离心机（Eppendorf公司，德国）；Fossmatic 5000型体细胞计数仪（FOSS 公司，丹麦）；Bovineα1-AGP ELISA Kit（购自上海谷研生物科技有限公司）；加州乳房炎检测法（CMT）试剂（购自福州佳宸生物科技有限公司）。

1．3 样品采集及鉴定

在采集乳汁之前，先用酒精棉球擦拭牛乳头进行消毒，弃掉头3把乳汁，人工挤压将乳汁挤入灭菌试管内，每份乳样50mL，冰浴保存后立即带回实验室。

采用体细胞计数仪进行乳汁体细胞计数，之后进行CMT检测：测试盘中倒入2mL的乳样，加入2mL的CMT试剂，混匀后轻轻作同心圆搅拌约15s进行观察。若混合液均匀且流动性好、无絮状物，则为阴性；混合液有微量颗粒但不久后消失，为可疑；有少许絮状物或沉淀产生但无凝胶，判断为弱阳性；凝结物呈胶状，摇动时呈中间集聚，停止摇动时沉淀呈凹状附着于盘底，判断为阳性；全部呈凝胶状，回转时向心集中，停止搅动则回复原状并附着于皿底，判断为强阳性。

1．4 乳清的制备

每份乳样取20mL，4℃ 4 000r/min离心25min，除去上层乳脂，再4℃ 12 000r/min离心15min，弃掉沉淀取乳清部分，然后将乳清样品分装成5mL/EP管，4℃保存备用。

1．5 乳清中α1-酸性糖蛋白含量的测定

按照Bovineα1-AGP ELISA Kit厂家操作说明书测定乳清样品中α1-AGP含量，加终止液后15min内进行测定，以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度（OD值），绘制标准曲线后计算样品中α1-AGP的含量。

1．6 数据统计分析

试验数据采用SPSS 13.0分析系统进行单因素方差分析，结果用“均值±标准误”表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2．1 α1-酸性糖蛋白标准曲线的绘制

α1-AGP标准品按浓度梯度进行稀释，读取各个浓度梯度的OD450nm值，以空白对照孔和标准孔中的蛋白质浓度（μg/mL）作为横坐标，OD450nm作为纵坐标绘制标准曲线（图1）。由图1可知，拟合直线回归方程为：Y=0.012X+0.004（R2=0.9985），浓度与吸光值拟合度较优，表明该方法检测α1-AGP的含量比较可信。

图1 α1-酸性糖蛋白标准曲线

2．2 乳清样品中α1-酸性糖蛋白的含量

由表1和图2可知，与健康对照组奶牛乳清中α1-AGP含量比较，轻、中、重度隐性乳房炎患牛乳清中α1-AGP 含量显著升高（P＜0.05），其中中度与重度隐性乳房炎组奶牛乳清中α1-AGP 含量升高趋势变化尤为明显，极显著高于轻度乳房炎组（P＜0.01）与健康对照组（P＜0.01）。试验结果表明，患不同程度的隐性乳房炎奶牛乳清中α1-AGP含量有着明显的差异，研究提示奶牛乳汁体细胞数增加及乳腺受损程度与乳清中α1-AGP含量呈正相关。

表1 不同程度隐性乳房炎患牛乳清中α1-AGP含量比较

图1 α1-酸性糖蛋白在隐性乳房炎患牛和健康奶牛乳清中含量的比较

3 讨论

当动物机体受到来自体内外的刺激、损伤或微生物感染引发炎症时，就会激发先天的免疫系统启动急性期反应（APR），进而导致血清急性期蛋白（APP）含量迅速升高到健康状态的数倍以上，在临床诊断中，APP常被认为是判断疾病状态最为重要的生物标记物[6]。APP主要由肝脏合成，也有研究表明，一些APP也可由乳腺上皮细胞在肝外进行合成[7]，在奶牛乳腺发生炎症时，血清中的APP可通过血乳屏障进入乳清中，在乳腺对抗感染、修复受伤组织及稳定内环境的生物过程中有着重要的作用[8]。隐性乳房炎发生时乳中APP含量的改变可提供乳区炎症阶段的特异信息，因此奶牛乳清中APP的含量可作为监测奶牛乳腺健康或疾病状态的重要指标。

α1-AGP作为急性期蛋白成员之一，在各种炎症或损伤等发生时，其在浆液中的表达逐渐升高，在机体杀死病原微生物对抗感染的过程中发挥重要作用。Jain等[9]发现Ⅱ型糖尿病伴有肾病综合征的患者血清中α1-AGP水平显著高于正常人，研究表明血清中α1-AGP含量可作为Ⅱ型糖尿病伴有肾病综合征的准确预测标志物，也有报道称血清α1-AGP浓度升高的Ⅱ型糖尿病患者并发心血管病死亡率的几率大大增加[10]。另外，一些研究也表明，在炎症、外伤、手术、类风湿关节炎、恶性肿瘤尤其在癌转移时，α1-AGP浓度升高更为明显[11,12]，在临床医学上α1-AGP常被认为是浆液中一种最重要的非特异性药靶。

本试验通过研究乳清中α1-AGP含量和乳腺感染之间的关系，发现患不同程度隐性乳房炎时，奶牛乳清中α1-AGP的含量也有明显的不同，隐性乳房炎患牛乳清中α1-AGP的含量显著高于健康对照组，并且随着隐性乳房炎病情的加重，乳清中α1-AGP含量也呈现逐渐上升的趋势；原因可能是由于隐性乳房炎发生时白介素-1刺激吞噬细胞释放出脂多聚糖，进而促进了α1-AGP的合成，使其表达水平升高。α1-AGP作为一种最稳定的早期呈阳性的急性时相反应物，推测其在奶牛隐性乳房炎疾病发生过程中发挥着重要作用。本研究结果表明，乳清中α1-AGP含量变化与隐性乳房炎的发病程度具有一定的相关性，不同发病阶段隐性乳房炎患牛乳清中α1-AGP含量变化特点为隐性乳房炎诊断方法的建立提供了新参考，同时也为隐性乳房炎快速诊断试剂盒的研发也提供了更为广阔的空间和前景。

[1]储明星,石万海,邝霞,等．浅谈奶牛乳房炎[J]．中国奶牛, 2001,23：39-40．

[2]郭小雅, 束婧婷, 杨章平,等．奶牛隐性乳房炎发生规律的调查分析[J]．中国兽医杂志, 2005, 3：23-24．

[3]Kushner I．The phenomenon of the acute phase response[J]．Ann NY AcadSci, 1982, 389(9)：39-48．

[4]Dilda F, Pisani LF, Rahman M．M, et al． Distribution of acute phase proteins in the bovine forestomachs and abomasum[J]．Vet J,2012, 192：101-105．

[5]Yanjie Bian, Ying Lv, Qingzhang Li． Identification of diagnostic protein markers of subclinical mastitis in bovine whey using comparative proteomics[J]．Bull Vet Inst Pulawy, 2014, 58：385-392．

[6]Eckersall PD．The time is right for acute phase protein assays[J]．Veterinary Journal, 2004, 168(1)：3-5．

[7]Hiss S,Mielenz M, Bruckmaier RM，et al． Haptoglobin concentration in blood and milk after endotoxin challenge and quantification of mammary Hp mRNA expression[J]．J Dairy Sci,2004, 87(11)：3778-3784．

[8]Eckersall PD,Young FJ,Mccomb C, et al．Acute phase protein in serum and milk from dairy cows with clinical mastitis[J]．Vet Record, 2001, 148(2)：35-41．

[9]Jain S, Rajput A, Kumar Y, et al．Proteomic analysis of urinary protein markers for accurate prediction of diabetic kidney disorder[J]．J Assoc Physicians India, 2005, 53(2)：513-520．

[10]Christiansen MS, Hommel E, Maqid E, et al．Orosomucoid in urine predicts cardiovascular and over-all mortality in patients with Type II dia-betes[J]．Diabetoloqia, 2002,45(1)：115-120．

[11]Heliovaara MK, Teppo AM, Karonen SL, et al．Improved glycaemia in type diabetes results in decreased levels of soluble adhesion molecules with no change in serum adiponectin or most acute phase proteins[J]．Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2006,114(6)：295-300．

[12]Crisman M V, Scarratt W K, Zimmerman K L．Blood prtein and inflammation in the horse[J]．Vet clin North Am Equine Pract,2008, 24(2)：285-297．

Abstract:In order to analyze the relationship between the changes of the content of alpha 1- acid glycoprotein,mastitis and whey in different stages, we selected 10 healthy cows and 30 different disease severity (light, medium and heavy) in subclinical mastitis milk samples as test animal, the content of alpha 1- acid glycoprotein were determined in whey samples using alpha 1- acid glycoprotein ELISA kit. The experimental results showed that the content of a 1- acid glycoprotein in cow mastitis whey group was significantly higher than that in healthy dairy group (P＜0.01 or P＜0.05), and with the increase of mastitis disease and milk somatic cell count, the content of a 1-acid glycoprotein in whey showed an increasing trend. Research results suggest that the extent of the disease has certain correlation with the content changes of 1- alpha acid glycoprotein, the content was positively related to alpha 1- acid glycoprotein and whey somatic breast lesions caused by mastitis and milk SCC.

Key word:Dairy cattle; Subclinical mastitis; Whey; Alpha 1- acid glycoprotein

《中国奶牛》征稿通知

《中国奶牛》杂志为月刊，读者对象为奶业管理者与生产者、专业技术人员、科研人员及奶牛养殖户等，读者群体覆盖整个奶牛业和乳品业的各个环节。栏目设置有科学研究、专家论坛、饲料饲养、繁殖育种、奶牛保健、发展论坛、乳与乳制品、质量安全、养殖环境保护、机械设施、牧草专栏、奶业经济等。

欢迎广大作者与读者投稿，2017年本刊原则上仍然不收审稿费与版面费，但对于加急稿件将适当收取加急费，若需加急，请作者务必与我编辑部电话联系。在线投稿系统网址为www．zgnn．org．cn。本刊审稿周期一般不超过3个月，请作者投稿后3个月内于在线投稿系统查询稿件录用情况，本刊不另行通知也不退回稿件。稿件一经录用，不得随意撤稿。另外，由于版面需要，本刊也需要一些奶业相关的精美照片，也请作者不吝赐予，一旦采用，报酬从优。

投稿要求：

1．全文字数不少于3500字；

2．研究论文要求有中英文摘要、关键词、英文题目和通讯地址；

3．第一作者及通讯作者简历，包括性别、出生年、籍贯、学历、职称、研究方向；

4．若与基金项目有关，请注明项目编号；

5．请勿一稿多投，文责自负；

6．照片像素不低于300点，图片大小不小于10cm。

7．请作者在投稿系统中注明电话、电子邮箱及QQ号等以便联系。

8．参考文献不少于8篇，以顺序编码方式标注。

联系方式：(010)62673004 62673764

投稿网址：www．zgnn．org．cn

咨询邮箱：zgnn126@126．com