微波辅助提取航天紫花苜蓿中总黄酮工艺研究

黄晓慧，张宏，李鹏，廖天江，赵静

（甘肃工业职业技术学院，天水 741025）

牧草专栏

微波辅助提取航天紫花苜蓿中总黄酮工艺研究

黄晓慧，张宏，李鹏，廖天江，赵静

（甘肃工业职业技术学院，天水 741025）

本研究通过单因素试验和正交试验设计确定微波辅助提取航天紫花苜蓿中黄酮的优化工艺条件：提取时间30min、乙醇浓度60%、微波功率600W、固液比1：15、提取温度80℃。

微波；航天紫花苜蓿；黄酮；提取工艺

紫花苜蓿有“牧草之王”的美称，经航天诱变选育的紫花苜蓿具有优质、高产，多叶率（5叶为主）高的特性[1]。苜蓿含有多种生物活性成分，在禽畜养殖、生物医药等领域有很高的利用价值。苜蓿中的黄酮类化合物结构多样，种类繁多，可有效清除人体内的自由基，有抗氧化作用和多种保健功效[2,3]。与传统中草药相比，以苜蓿作为黄酮类化合物的来源，具有资源丰富、价格低廉等特点。苜蓿是大田作物，适宜大规模种植，产量较高；将苜蓿提取物加工后作为饲料添加剂应用，具有安全环保的特点；把苜蓿黄酮类化合物等活性成分的产品加入到草业产业链中，不仅能增加苜蓿的经济附加值，还可以延长产业链、提升产业层次，促进生产和科研的发展[4]。

苜蓿中黄酮的提取多采用乙醇提取法。微波法是近20年来迅速发展起来的提取新技术，具有无噪声、能耗低、效率高、不破坏活性成分的特点[5]。目前国内对于航天育种紫花苜蓿营养价值和有效成分提取分离的相

关研究较少，对其在实际生产中的应用结果更是鲜有报道。本文研究了应用微波技术辅助提取航天紫花苜蓿总黄酮的工艺，旨在为航天绿色药材的开发提供一定的理论依据。

1 材料

1．1 试验材料

航天紫花苜蓿全草取自天水国家高新农业园区甘肃省航天育种工程技术中心，经中国科学院西北高原生物研究所赵强博士鉴定，将苜蓿风干、粉碎、过筛、备用；黄酮（芦丁）对照品（国药集团化学试剂有限公司产品）；水为去离子水；其余试剂均为分析纯。

1．2 仪器

XH-100A型微波催化合成/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）、759型紫外可见分光光度计（浙江福立分析仪器有限公司）、SHB-IV22A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、FA2104型电子天平（成都一科仪器设备有限公司）。

2 方法

2．1 标准曲线绘制

精密称取芦丁对照品0.0258g，置于25mL容量瓶中，以80%乙醇溶解并用去离子水稀释至刻度，摇匀，得贮备液（浓度为1mg/mL）。分别取贮备液配制成黄酮浓度为0.00mg/mL、0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL的标准溶液，做两份平行样，于510nm波长处测定吸光度[6]，制作绘制标准曲线。

2．2 工艺研究

2.2.1 黄酮提取试验

称取5.0g航天紫花苜蓿干粉，置于磨口三颈瓶中，加一定浓度的相应体积的乙醇溶液。放置在XH-100A0型微波催化萃取仪中，在一定温度、功率条件下，连续微波辐射一定时间后，抽滤；滤液加石油醚萃取3～5次，去除叶绿素干扰[7]，浓缩，用相应浓度的乙醇溶液将滤液定容至100mL，于510nm波长处测定吸光度，并计算黄酮含量。

黄酮含量（mg/g）=（C·V）/m

式中，C为提取液中黄酮质量浓度（mg/mL）；V为提取液总体积（mL）；m为原料干粉质量。

2.2.2 单因素试验

开展在正交试验之前进行单因素试验，分别考察提取时间、提取温度、固液比、乙醇浓度和微波功率对含量的影响。

2.2.3 正交试验

为确定提取过程中各因素对黄酮含量影响的大小，将优化后的提取时间（A）、乙醇浓度（B）、微波功率（C）、固液比（D）、提取温度（E）5个因素，以L10(45)正交表进行试验设计。因素水平如表1。

表1 因素水平

3 结果与分析

3．1 芦丁标准曲线

图1 黄酮标准曲线

芦丁标准曲线如图1所示。结果表明，芦丁检测浓度在0～1.0mg/mL范围内与吸收度呈良好线性关系（R2=0.9998），得其回归方程为：Y=0.2956X-0.0013（其中，Y为吸光度，X为检测浓度）。

3．2 单因素试验结果

3.2.1 提取时间对黄酮含量的影响

按照2.2.1所述方法，拟定提取温度60℃、固液比1∶15、微波功率600W条件下用50%乙醇溶液提取一次，考察不同提取时间对黄酮含量的影响，结果如表2所示。

表2 提取时间对黄酮含量的影响

由表2可知，该条件下微波提取30min后，提取的黄酮含量趋于平衡，不随提取时间的增加而变化，故选择提取时间30min为宜。

3.2.2 提取温度对黄酮含量的影响

按照2.2.1所述方法，提取时间由3.2.1确定，拟定固液比1∶15、微波功率600W条件下用50%乙醇溶液提取一次，考察不同提取温度对黄酮含量的影响，结果如表3所示。

表3 提取温度对黄酮含量的影响

由表3可知，60～80℃范围内，黄酮含量随着温度的升高先增大后减小，80℃时提取的黄酮含量相对达到最大，故选择提取温度80℃为宜。

3.2.3 固液比对黄酮含量的影响

按照2.2.1所述方法，提取时间由3.2.1确定，提取温度由3.2.2确定，拟定微波功率600W条件下用50%乙醇溶液提取一次，考察不同固液比对黄酮含量的影响，结果如表4所示。

表4 固液比对黄酮含量的影响

由表4可知，黄酮含量随着固液比的增大而增加，但该增长趋势并不显著，即固液比对黄酮含量的影响不大，故选取的溶剂量只需将原料完全浸没即可，则固液比选取1∶15为宜。后续单因素试验均以固液比1∶15进行操作。

3.2.4 乙醇溶液浓度对黄酮含量的影响

按照2.2.1所述方法，提取时间由3.2.1确定，提取温度由3.2.2确定，固液比由3.2.3确定，拟定微波功率600W条件下用不同浓度乙醇溶液提取一次，考察不同乙醇溶液浓度对黄酮含量的影响，结果如表5所示。

表5 乙醇溶液浓度对黄酮含量的影响

由表5可知，黄酮含量随着乙醇浓度的增大呈现出先增大后减小的变化；当乙醇溶液浓度为60%时黄酮含量最高，故选择60%乙醇进行提取为宜。

3.2.5 微波功率对黄酮含量的影响

在3.2.1、3.2.2、3.2.3和3.2.4确定的最佳因素条件下，考察不同微波功率对黄酮含量的影响，结果如表6所示。

表6 微波功率对黄酮含量的影响

由表6可知，微波功率设定为600W时，同等条件下黄酮的提取含量可达最大值，故选择微波功率600W为宜。

3．3 单因素试验验证结果

单因素试验条件下得出了优化工艺参数：提取时间30min、乙醇浓度60%、微波功率600W、固液比1∶15、提取温度80℃。相同工艺条件下重复3批原料的提取试验，结果如表7。

表7 单因素试验结果

3．4 正交试验结果

正交试验结果见表8，方差分析结果如表9表示。

表8 正交试验结果

表9 方差分析结果

由表8、表9可知，各因素对黄酮提取含量影响的大小顺序为：提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞微波功率＞固液比。提取温度影响最大，固液比影响最小。由直观的极差分析初步认为优化工艺参数是A4B3C2D4E4，即提取时间30min、乙醇浓度70%、微波功率600W、固液比1∶25、提取温度80℃。

3．4 正交试验验证结果

按照A4B3C2D4E4条件下重复3批原料的试验进行验证，结果如表10。

表10 验证试验结果

3批验证试验结果比较接近，说明该优化工艺基本稳定，适用于从航天紫花苜蓿中提取黄酮。

相比较，正交试验验证的黄酮含量9.04mg/g略低于单因素验证试验的9.48mg/g，这是由提取条件中乙醇浓度和固液比这两个影响因素的参数不同而引起的。然而，单因素试验和正交试验结果中均显示固液比对黄酮含量的影响很小，若将固液比的影响忽略不计，则可视作同等条件下，60%乙醇提取黄酮含量略高于70%乙醇提取的量，故可考虑选择60%乙醇进行提取，提高黄酮含量的同时也可减少乙醇的用量。

3 结论

黄酮类化合物的传统提取方法主要是水煎法，主要缺点是提取效率低、能耗大。超声波辅助提取法可用来提取黄酮类化合物，但存在噪声污染等问题从而难以广泛应用[8]。相比较而言，微波辅助萃取天然产物中活性成分具有设备简单、适用范围广、萃取效率高、重现性好、节省时间、节省试剂、污染小等特点。采用微波辅助提取航天紫花苜蓿的工艺方法，单因素试验与正交实验结果比较接近，考虑到实际操作中固液比和时间的增大会增大能耗，并且增大后续工作难度，因此将该工艺条件定为：提取时间30min、乙醇浓度60%、微波功率600W、固液比1∶15、提取温度80℃。

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Abstract:This study was to optimize the parameters for extraction of flavonoids from space breeding alfalfa by microwave-assisted method through single factor design and orthogonal test. And the optimum conditions of the extraction process were as follows: 30min of microwave-assisted extraction time, 60% of ethanol concentration,600W of microwave power, 1:15 of solid-liquid ratio, and 80℃ of extraction temperature.

Key words:Microwave; Space breeding alfalfa; Flavonoids; Extraction process

Study on Microwave-assisted Extraction Process of Total Flavonoids from Space Breeding Alfalfa

HUANG Xiao-hui, ZHANG Hong, LI Peng, LIAO Tian-jiang, ZHAO Jing
(Gansu Industry Polytechnic College, Tianshui 741025)

S823.3

A

1004-4264（2017）09-0061-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.09.016

2017-06-10

甘肃省高等学校科学研究自筹经费项目（2015B-154）。

黄晓慧（1983-），女，汉族，讲师，硕士，主要从事化学分析、化工技术方面的专业研究及教育教学工作。