一种新型炭化装置的研制及其在单质硒检测中的应用

2017-10-16王凤芹路则庆宋德广汪以真

分析科学学报 2017年1期

王凤芹，张林，路则庆，宋德广，汪以真*

(浙江大学动物科学学院，农业部华东动物营养与饲料重点实验室，浙江省饲料及动物营养研究实验室，浙江杭州 310058)

自Shrift和Kelly[1]于1962年首次报道大肠杆菌耐受亚硒酸盐的毒性并将其还原成单质硒以来，由微生物介导的还原亚硒酸盐和硒酸盐为单质硒的研究备受关注[2]。文献报道[3 - 4]细菌合成的单质硒聚合成为纳米硒颗粒，其不仅具有抗氧化能力同时降低了硒的毒性[5]。并有研究表明：一定剂量的纳米单质硒对实验动物具有免疫调节功能[6]，纳米单质硒作为独特的抗氧化剂正被用于临床治疗[7]。单质硒不溶于水、醇，溶于硫酸、硝酸，硒在二硫化碳中的溶解度也较低只有0.64 mg/mL[8]，给样品中硒的提取带来困难，其次是二硫化碳有毒。

目前，对于单质硒的研究，主要是基于X射线衍射、扫描电镜或透射电镜进行的定性或表征分析，只有少数研究涉及单质硒的提取和定量测定[8]。万雯等[9]与侯晓川等[10]采用真空蒸馏法提取硒，实现了单质硒与高沸点难挥发的其他物质的分离，但此法仅仅应用于粗硒的提纯，而不适用于基于定量分析微量和痕量硒为目的的单质硒收集。Biswas等[11]报道直接采用1 mol/L Na2S水溶液提取细菌生物合成的纳米硒，再经紫外分光光度法测定，但实际上提取的不仅仅是单质硒，还包括了其它价态的硒和样品中的其他基质，从而造成检测结果远远高于单质硒的实际含量。

本研究设计了一种新型、经济的炭化装置，该装置可用于分离和富集单质硒同时免受基质干扰。样品在加热过程中，有机物灼烧后被破坏，氧化态的硒如Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)的盐不能被蒸发，保留在残渣中，而单质硒因其低沸点而升华并冷凝附着在上盖内壁或空气冷凝管的内壁。加热过程既分离了单质硒与其他杂质，也使单质硒得到富集。富集得到的单质硒经酸加热消化后，在盐酸介质中，将试样中的硒统一还原成四价硒，四价硒在微酸性条件下与2，3-二氨基萘(DAN)生成苤硒脑络合物，用环己烷萃取，并测定其荧光强度，从而计算出样品中的单质硒含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

C20L-NL909T电磁炉(林光电子有限公司);Softmax pro5多功能连续光谱酶标仪(美国,Molecular Devices公司)；集热式恒温加热磁力搅拌器(杭州惠创仪器设备有限公司)；数显恒温水浴锅(常州国华)；pH计(美国Mettler Toledo 公司)。

硒蛋白多糖样品(本课题组富硒菌株Z0206发酵醇沉产品)，Na2S(分析纯，国药集团)，色谱级硒粉和分析纯2，3-二氨基萘(DAN)购于Sigma公司。氨水、高氯酸、浓硝酸、EDTA二钠盐、盐酸羟胺、环己烷均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产。实验用水为纯水仪(日本，Yamato公司)制备。

1.2 反应试剂的配制

DAN试剂(1.0 g/L)：此试剂在暗室内配制。称取DAN(纯度95%～98%)200 mg 于一带盖锥形瓶中，加入0.1 mol/L 盐酸200 mL，振摇约15 min 使其全部溶解。加入约40 mL 环己烷，继续振荡5 min。将此液倒入塞有玻璃棉或脱脂棉的分液漏斗中，待分层后分去环己烷层，收集DAN 溶液层，反复用环己烷纯化，直至溶液的荧光强度降至最低时为止(约纯化12 次)。将纯化后的DAN 溶液储存于棕色瓶中，加入约1 cm 厚的环己烷覆盖表层，于冰箱内保存。EDTA混合液：称取EDTA 二钠盐2.5 g，加水并加热至完全溶解，冷却后稀释至125 mL，然后加入6.25 g 盐酸羟胺，溶解后稀释至250 mL。

1.3 新型炭化装置的设计

图1 炭化装置实物图Fig.1 Carbonization device

整套装置采用硼硅酸盐玻璃材质，包括玻璃杯底座、上盖腔体，玻璃杯底座设有磨口裙边，上盖腔体的底部设有相应吻合的磨口裙边，上盖腔体的顶部接有一个空气冷凝管，空气冷凝管与上盖腔体的垂线以夹角120度伸出后再垂直向下延伸；玻璃杯底座、上盖腔体采用鱼尾夹对称固定；玻璃杯底座、上盖腔体、空气冷凝管的玻璃厚度为0.3 cm；玻璃杯底座内径为2.3 cm，高1 cm，磨口裙边宽1.2 cm；上盖腔体磨口裙边宽1.2 cm，腔体内径2.3 cm，高7 cm，空气冷凝管内径0.5 cm，总长度30 cm，其中冷凝管与垂线(腔体)120度夹角延伸20 cm后垂直向下延伸10 cm，见图1。

1.4 实验步骤

1.4.1单质硒的分离与富集准确称取约25 mg硒粉，同时称取约200 mg NaCl，置于装置的玻璃杯底座中，混匀，盖上上盖腔体，将上下两个磨口裙边部位完全吻合放置，并用鱼尾夹对称固定；上述装置放在电磁炉的加热板上，300 ℃加热30 min；冷却后用1 mol/L Na2S水溶液将腔体包括冷凝管部分的硒粉无损转移至容量瓶中，并用Na2S水溶液定容至25 mL。再从容量瓶中取1 mL硒的Na2S水溶液，用Na2S水溶液定容至500 mL。

准确称取约50 mg样品，同时称取约200 mg NaCl，按上述操作。冷却后用5 mL 1 mol/L Na2S水溶液将腔体包括冷凝管部分的单质硒无损转移至离心管，摇匀备用。

1.4.2酸解及检测将上述制得的标样或者样品溶液0.5 mL，于100 mL的圆底烧瓶中，加入1 mL的质量百分比为69%的浓硝酸，再加入2 mL质量百分比为70%～72%的高氯酸，置于沸水浴中磁力搅拌1 h；反应结束冷却后，加入8.4 mL浓度为6 mol/L的盐酸，置于沸水浴中反应10 min，冷却后用水定容至100 mL。

移取上述定容后的酸解溶液5 mL，用氨水和盐酸调节pH至 1.5～2.0，加入3 mL EDTA 混合液摇匀后，加入3 mL DAN溶液，摇匀，补充水至总体积约30 mL，置于沸水中保持5 min，取出冷却至室温；然后将其转移到125 mL分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，参照我国国家标准《食品中硒的测定》法[12]和《饲料中硒的测定》[13]进行操作，在激发波长376 nm、发射波长520 nm条件下测定环己烷层的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 炭化条件的选择

设置加热时间为30 min，分别设置炭化温度为150 ℃、300 ℃和 400 ℃对硒粉进行加热，发现温度设置为300 ℃能够获得最大的回收率；设置加热温度为300 ℃，分别设置炭化时间为15 min、30 min 和 60 min，发现时间设置为30 min时已经能够获取满意的回收率。另一方面，参考常规重金属测定炭化时防喷溅剂的使用[14 - 15]，考察了将CaO、MgO、Mg(NO3)2、Ca(OH)2和NaOH作为对样品加热过程中的防喷溅剂对样品加收率的影响，发现在选择这些化学试剂作为防喷溅剂时，回收率均不理想。经过实验选择NaCl作为防喷溅剂，获得十分满意的回收率。

2.2 线性关系和精密度

准确称取亚硒酸钠，用蒸馏水定容稀释，得到每毫升含0.2 μg 硒的工作液。分别准确吸取0、0.2、0.6、1.0、3.0以及8.0 mL硒标准工作液。用水稀释至30 mL，同1.4.2样品检测方法进行测定。每个体积的标准品测定3次，测定其荧光值，用得到的荧光值(平均值)对单质硒的质量作图制作标准曲线。结果表明：单质硒在0.0～1.6 μg范围内线性关系良好，线性相关系数R2为1.0000，其线性回归方程为：Y=1849.68X+27.85。计算荧光值的相对标准偏差(RSD)为2.52%，表明精密度良好。

2.3 重现性及回收率

精确称取5份约25 mg硒粉，按照“1.4.1和1.4.2”方法操作，并重复测定5次，求平均值。5份样品测得单质硒的含量结果分别为97.77%、99.44%、100.20%、101.20%、103.34%，其平均值为100.39%，由此计算出相对标准偏差(RSD)为0.95%。表明方法的重现性好，回收率高。

2.4 硒多糖中单质硒检测

精确称取5份硒多糖样品，按照“1.4.1和1.4.2”方法操作，并重复测定3次，求平均值。5份样品测定单质硒的含量结果分别为1869.6 μg/g、2004.0 μg/g、1870.19 μg/g、1937.72 μg/g、1934.62 μg/g，平均值为1923.23 μg/g，由此计算出相对标准偏差(RSD)为2.91%。