液相色谱-串联质谱法快速测定蔬菜中19种农药残留

万建春， 郭 平， 祝建新， 占春瑞*， 左海根

(江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，江西南昌 330038)

图1 19种农药极性强度排列图Fig.1 Arrangement diagram of polar intensity of 19 pesticidesC1：Acetamiprid,C2：Atrazine,C3：Buprofezin,C4：Carbendazim,C5：Carbofuran,C6：Difenoconazole,C7：Dimethomorph,C8：Hexythiazox,C9：Imazalil,C10：Imidacloprid,C11：Isoproturon,C12：Methomyl,C13：Omethoate,C14：Prochloraz,C15：Profenofos,C16：Prometryne,C17：Pyrimethanil,C18：Triadimenol,C19：Triazophos，the same below.

QuEChERS方法是近年得到快速发展和推广运用的一种快速前处理技术，它非常适用于含水量大的蔬菜、水果等农产品的农药残留快速测定，在农残检测方面有较多的实际应用[1 - 12]。QuEChERS方法常用的吸附剂有N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化碳黑(GCB)、无水MgSO4等。PSA具有弱阴离子交换和极性作用，能去除萃取液中脂肪酸，有机酸，极性色素以及糖类等物质[4]；C18粉含碳量在10%左右，具有疏水作用，对非极性的组分有吸附作用，能除去萃取液中非极性色素，脂肪酸等物质；GCB有六边形的微观结构，可吸附非极性和弱极性化合物，尤其对色素吸附作用较好，GCB表面的特殊的六边形结构，使它能吸附具有平面结构的化合物[13 - 14]。

本文选择了啶虫脒(Acetamiprid)、莠去津(Atrazine)、噻嗪酮(Buprofezin)、多菌灵(Carbendazim)、呋喃丹(Carbofuran)、苯醚甲环唑(Difenoconazole)、烯酰吗啉(Dimethomorph)、噻螨酮(Hexythiazox)、抑霉唑(Imazalil)、吡虫啉(Imidacloprid)、异丙隆(Isoproturon)、灭多威(Methomyl)、氧乐果(Omethoate)、咪鲜胺(Prochloraz)、丙溴磷(Profenofos)、扑草净(Prometryne)、嘧霉胺(Pyrimethanil)、三唑醇(Triadimenol)、三唑磷(Triazophos)19种农药，其极性差异如图1所示。极性相当的化合物结构上也有所不同，如多菌灵和嘧霉胺是具有平面结构的化合物，实验加入甲苯作为保护剂，以确定保护剂与吸附剂之间的交互作用，得到适合不同化学性质的QuEChERS吸附剂和保护剂组合方式，为方法拓展检测项目提供了参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6495液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(美国,Agilent)；IKA-T25高速组织匀浆机(德国,IKA公司)；Milli-Q超纯水机(美国,Millipore公司)；Vortex-Genie 2涡旋混匀器(美国,Scientific Industries公司)；TDL-5-A常速离心机(上海安亭公司)，SIGMA 1-14微量离心机(美国,Sigma公司)。

19种农药标准品纯度>95%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司和中国农业部环境保护科研监测所。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Sigma公司)；三氯甲烷(色谱纯，上海安谱公司)；乙酸铵(色谱纯，上海安谱公司)；水为Milli-Q超纯水；PSA粉(40～60 μm)、C18粉(50 μm)、GCB粉(100～400 目)，购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；无水MgSO4(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，使用前在640 ℃灼烧4 h。

1.2 溶液的配制

标准储备溶液：分别称量或移取适量的各种农药标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，于-18 ℃避光保存。混合标准中间溶液：移取一定量的标准储备溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混合标准溶液于4 ℃避光保存。提取液：分别量取50 mL甲酸和250 mL乙腈，加水溶解并定容至1 000 mL，现配现用。

1.3 样品前处理

称取试样10.0 g至50 mL聚丙烯离心管内，加入10 mL提取液，高速匀浆提取1 min，加入10 mL三氯甲烷，于4 500 r/min离心5 min，弃去全部上层溶液和残渣，将下层有机相全部转移至15 mL聚丙烯离心管中，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL乙腈和1 mL甲苯，涡旋混合均匀后，准确移取1 mL复溶液至10 mL 聚丙烯离心管中，向离心管中加入混合吸附剂(PSA：50 mg，GCB：20 mg，无水MgSO4：100 mg)后，快速混匀，在4 500 r/min下离心5 min，取全部上层清液至另一10 mL聚丙烯离心管中，在40 ℃下氮吹至干，用1 mL定容液(0.1%甲酸水溶液∶乙腈=8∶2)超声溶解，过0.22 μm滤膜后，供LC-MS/MS测定。

1.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱为Shiseido CAPCELL PAK CR柱(150×2.1 mm，3.5m)；柱温：40 ℃；流动相A为乙腈，流动相B为5 mmol乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)；流速0.4 mL/min；进样体积；5L；梯度洗脱程序：0～3.0 min，1%～30%A；3.0～6.0 min，30%～40%A，保持3 min；9.0～15.0 min，40%～60%A；15.0～19.0 min， 60%～90%A，保持4 min;23.0～23.01 min;流动相A由90%瞬变至1%后，保持4 min。

质谱条件：离子源(ESI+)；多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：3 000 V；干燥气温度：280 ℃；干燥气流量：14 L/min；雾化气压力：20 psi；鞘气温度：325 ℃；鞘气流量：11 L/min。以1.0 μg/mL标准混合液，利用Agilent 6495自动优化软件，选择各化合物的其它质谱参数见表1。

表1 质谱参数

*quantitative ion pair.

2 结果与讨论

2.1 液相条件的建立和优化

反相C18色谱柱对非极性化合物有较好的保留作用，在质谱正模式分析中，流动相中加入一定量的挥发性酸可提高离子化效率，进而提高灵敏度，但对碱性化合物来说，酸性环境下会有离子化趋势，其色谱行为变差，保留时间短，更易受基质中极性物质的干扰，化合物峰展宽也变宽，影响其灵敏度。本方法比较了Shiseido CAPCELL PAK CR色谱柱和反相C18色谱柱的分离效果，CR色谱柱的固定相是SCX和C18复合填料，能够避免碱性化合物因离子化而导致色谱行为变差的现象，多菌灵、灭多威等极性化合物有较好的色谱保留，低比例的SCX填料也不会造成碱性化合物的死吸附。

2.2 前处理方法的优化

图2 吸附剂对19种农药的吸附作用强度Fig.2 Adsorption of 19 kinds of pesticides by adsorbent

实验选择常用吸附剂PSA、C18、GCB、无水MgSO4，分别考察各吸附剂对各农药的吸附作用强度，用乙腈配制一定浓度的19种农药混合溶液，分别加入100 mg的PSA、C18、GCB、无水MgSO44种吸附剂处理后，经溶剂转换后上机测定，实验结果如图2所示。多菌灵和嘧霉胺是平面结构化合物，GCB对这两种农药有较强的吸附作用，C18对弱极性的噻螨酮和三唑磷也有较强的吸附能力，而无水MgSO4对咪鲜胺的影响则较大，PSA对19种农药无显著吸附作用。为降低GCB对平面结构化合物的影响，试验加入甲苯作为保护剂，设置A、B、C、D、E 5个因素，每个因素取4个水平，以蔬菜样品中检出农药数量为考察指标，进行正交试验。从正交试验结果直观分析来看，4个因素的极差有一定的差异，PSA、甲苯、GCB对待测物的吸附作用相对明显，而C18和无水MgSO4则影响相对较小，而PSA、甲苯、GCB两两间有一定的交互作用，20 mg GCB加入250 mL甲苯，GCB对平面结构的化合物吸附能力有明显改善，50 mg PSA加入500 mL甲苯，PSA净化溶液检出了全部农药，而20 mg GCB和50 mg PSA的组合，净化溶液检出全部19农药。正交试验的结果显示，PSA(50 mg)、甲苯(1 mL)、GCB(20 mg)的组合方式的试验结果最理想，考虑试样溶液含水，在溶剂转换过程中会影响测定结果，吸附剂组合中增加无水MgSO4(100 mg)。

表2 正交试验设计(5因素4水平)

表3 正交试验结果

(续表3)

Experiment No.12345PSAGCBC18MgSO4TolueneResult113312418123421317134142317144231419154324115164413216k118.50018.25018.00018.00016.750k218.00018.25017.50017.75017.500k317.25017.00018.00017.25017.750k416.75017.00017.00017.50018.500Range1.7501.2501.0000.7501.750

Note:kiis mean value corresponding toifactor.

图3 19种农药的基质效应Fig.3 Matrix effects of 19 pesticides

2.4 测定低限和校准曲线

本实验用阴性蔬菜样品进行加标实验，计算待测物的信噪比(S/N)确定方法的定量限。QuEChERS吸附剂在吸附共萃取物的同时，对待标物也有一定吸附作用，其程度除与待测物性质有关外，共萃取物的量是重要因素，这些都是影响QuEChERS方法的基质效应的因素。本方法考察了19种农药在蔬菜中的基质效应，19种农药在蔬菜基质中呈现较明显的基质抑制效应(图3)，为消除基质效应对定量结果的影响，本方法采用基质匹配标准工作曲线进行定量。在50～1 000 ng/mL浓度范围，各化合物线性相关性较好，表4是各化合物的线性回归方程、相关系数、定量限数据。

表4 蔬菜样品中各化合物的回归方程、相关系数、定量限

2.5 准确度和精密度

本方法采用阴性蔬菜样品的加标实验进行的准确度和精密度评价，实验分别在1、2和4倍定量限浓度水平进行加标实验，添加回收实验结果显示，各农药回收率在65.4%～120.0%范围，相对标准偏差在3.35%～17.46%之间。

3 结论

本文建立了蔬菜中19种农药残留量的测定方法，方法采用SCX和C18复合填料的色谱柱分离，流动相中加入甲酸，碱性和极性化合物均有较理想的色谱峰形，提高了质谱检测的灵敏度。通过正交试验设计，得到了QuEChERS净化用吸附剂和保护剂理想的组合方式。采用本方法对油麦菜、小白菜、黄瓜、生菜、芹菜等50余个蔬菜样品进行测定，其中农药多菌灵检出率最高，其次为啶虫脒。