胰岛素结构改造的研究进展

李修政，林於红，董家潇，叶光明，姜云云

(1.安徽医科大学解放军九八临床学院，浙江 湖州 230032；2.杭州康恩贝制药有限公司，浙江 杭州 310051；3.解放军101医院，江苏 无锡 214044)

胰岛素结构改造的研究进展

李修政1，林於红2，董家潇1，叶光明3*，姜云云3*

(1.安徽医科大学解放军九八临床学院，浙江 湖州 230032；2.杭州康恩贝制药有限公司，浙江 杭州 310051；3.解放军101医院，江苏 无锡 214044)

胰岛素是一种由胰腺分泌的激素，一直是治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物。由于胰岛素是一种天然的多肽类化合物，因此存在稳定性差、体内代谢快等缺陷。针对这些问题，科研人员一直致力于对胰岛素进行结构改造以开发出新型的胰岛素类抗Ⅱ型糖尿病药物。简述了胰岛素的结构及作用特点，综述了近年来胰岛素结构改造的研究进展，如对胰岛素二硫键的修饰、胰岛素序列的改造、胰岛素肽链N-末端的修饰等，指出了开发高活性、低成本、高稳定性的胰岛素结构改造类似物将是该领域未来发展的主要方向。

胰岛素；类似物；结构改造；二硫键；糖尿病

Abstract：Insulin is a hormone secreted by the pancreas,which has been a first-line drug for the treatment of type Ⅱ diabetes.As a natural peptide compound,insulin has defects of poor stability and rapid metabolism invivo.Aiming at these problems,researchers have been committed to the structural modification of insulin in order to develop new types of insulin-like anti-type Ⅱ diabetic drugs.We briefly introduce the structure and characteristics of insulin,and emphatically review the research progress in the structural modification of insulin in recent years,such as the modification of disulfide bond of insulin，insulin sequences,and the N-terminus of insulin peptide chain.We also point out that development of insulin structural modification analogues with high activity,low cost，and high stablibity will be the main direction of future development.

Keywords：insulin;analogues;structural modification;disulfide bond;diabetes

1922年，Banting和Best第一次将胰岛素用于临床治疗中，并取得了较好的效果。但胰岛素最初只能从动物的胰腺中提取，而且得到的是粗产品。直到1960年，色谱技术被发现后，胰岛素的分离纯化才逐步被完善。我国在1965年完成了人工牛胰岛素的全合成，这对于国际多肽合成领域的发展具有重大意义；20世纪70年代末，丹麦诺和诺德公司生产出半合成胰岛素；1982年，美国礼来公司首次利用DNA重组技术合成人胰岛素。胰岛素是一种天然的多肽类化合物，存在稳定性差、体内代谢快等缺陷。针对这些问题，科研人员一直致力于对胰岛素进行结构改造，1996年，第一个胰岛素类似物通过对胰岛素化学结构的改造和修饰而得到。目前，已经有300多个胰岛素类似物被开发出来，有些已进入临床应用[1]。作者综述了近年来胰岛素结构改造的研究进展，以期为合成高性能的胰岛素类似物提供参考。

1 胰岛素的结构及其作用特点

胰岛素含有2条肽链，共有51个氨基酸残基(图1)。A链由11种21个氨基酸残基组成，N端到C端依次是GIVEQCCTSICSLYQLENYCN，其中A6-A11由二硫键相连成环；B链由16种30个氨基酸残基组成，从N端到C 端依次是 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT，而A链和B链又通过2个二硫键在CysA7-CysB7和CysA20-CysB19上相连构成胰岛素分子。不同动物胰岛素的组成中，氨基酸残基的排列顺序大都不相同[2]。研究发现，在诸多动物胰岛素中，猪胰岛素结构与人胰岛素比较接近，所以早期人们常常使用猪胰岛素作为临床上的治疗剂，也在此基础上进行合成和改造。

图1 胰岛素的化学结构Fig.1 Chemical structure of insulin

2 胰岛素结构改造的研究进展

目前，市场上使用的胰岛素大多通过DNA重组技术生产[3]，以满足巨大的全球需求。然而，如果化学合成的新型胰岛素有效，则可以作为小众市场(热稳定性是一个区域性的问题)的治疗剂。由于常规胰岛素及其类似物有3个完全保守的二硫键的经典结构，这些结构对胰岛素的稳定性至关重要，所以研究人员致力于开发较稳定且高效的胰岛素及其类似物。胰岛素及其类似物进入人体后，也存在许多潜在的问题：二硫键对某些还原剂(如硫醇)以及二硫化物异构酶不稳定，易导致结构重排和活性丧失。基于这种情况，研究人员向胰岛素分子中引入更稳定的电子等排体，例如，用三唑[4-6]、硫醚[7]、硒醚[8]、内酰胺[9-10]等替换结构中的一个或几个二硫键，以使其具有更好的热稳定性。此外，胰岛素序列的改造、末端修饰也具有重要意义。

2.1 基于二硫键的修饰

2.1.1 三唑替换CysA7-CysB7 中的二硫键

研究表明，CysA7-CysB7二硫键不同于其它2个二硫键，其占据胰岛素的表面和空间结构中不整齐的区域，潜在地允许用一些稳定的模拟物替代这个二硫键。基于这个因素，Williams等[11]在前人工作的基础上，提出了一种用1,2,3-三唑替换CysA7-CysB7二硫键的新的修饰方法。这种方法是通过固相肽合成(solid phase peptide synthesis,SPPS)方法在A链中的A7位置上形成一个炔丙基，在A20位置上用Acm作巯基的保护基。而B链是在类似于Wang树脂的结构上进行，使其在B7位置上形成一个叠氮，B19同样用Acm作巯基的保护基。在一定条件下，这2条链可形成一个多肽，然后对其切割，紧接着进行固相氧化，形成二硫键，再加入CuI通过Click反应[12]最终实现用三唑替换二硫键的结构修饰(图2)。Williams等[11]在芋螺毒素MrIA中用三唑替换二硫键，使去甲肾上腺素的抑制活性功能保留，由此推测是由于对部分结构的还原和相关的空间折叠敏感性降低。Holland-Nell等[4]在Tachypiesin I中，用三唑替换二硫键，使抗菌肽的结构更接近完美的模拟，并且还显示出较好的抗微生物活性。在A7和B7位置上成功引入1,2,3-三唑环，说明用三唑作为一个替代物在理论上是可行的，甚至在体内有耐降解的可能性，但分析结果表明，该替代物在体内的作用不明显。所以，该模拟物在链中的位置以及替代的基团需要进一步研究。

图2 三唑替换二硫键的胰岛素化学结构Fig.2 Chemical structure of insulin with triazole replace of disulfide bond

2.1.2 硫醚替换二硫键

基于胰岛素及其类似物的结构特点，研究人员选用硫醚替换二硫键[13-15]，因为硫醚更接近于模拟生物活性肽和蛋白质中的二硫键(图3)。研究人员通过SPPS方法，使A链上的二硫键脱去一个硫[S-CH2]。二硫键的脱硫是形成硫醚的一种方法[16]，这个反应在固相载体[17]上进行。通过游离硫醇盐和卤化侧链之间发生的SN2反应，最终形成一个大环。但由于卤素的空间位阻较大和易发生水解反应，反应的产率较低。针对这个弊端，使用预先形成的具有正交保护的硫醚结构单元[13-14]，与内酰胺反应，最后生成大环。类似的替换方法还有很多，例如，Araujo等[8]发现硒醚可以很好地模拟胰岛素中的二硫键，并且使其更加稳定。这种方法的功效已经在肽(催产素)中得到证实，其中合成的硒醚类似物的热稳定性增加了20倍。

Cui等[13]制备了多种二碳环肽，其结构接近于天然产物，并且可以增强在生物体内的结构稳定性。

图3 硫醚替换二硫键的胰岛素化学结构Fig.3 Chemical structure of insulin with thioether replace of disulfide bond

2.2 基于胰岛素序列的改造

Brems等[18]将B29位的赖氨酸与脯氨酸的残基进行交换获得修饰物1(图4)。该修饰物能降低寡聚形式的稳定性，使胰岛素更快地解离，进入到循环系统中，达到治疗效果。类似的策略在天冬胰岛素和谷氨酸胰岛素中也被应用，在其B链上含有2个取代：天冬酰胺取代B3中的赖氨酸(修饰物2，图4)，谷氨酸取代B29中的赖氨酸(修饰物3，图4)。第一种作为长效药物上市的是NPH胰岛素[19]，其作用时间大约持续15～18 h;但是这种药物也存在问题，因为胰岛素在进入人体内6 h后达到峰值，因此，它不能在睡前服用，以避免夜间低血糖的发生。为此，Vague等[20]开发了甘精胰岛素，A21位的天冬酰胺被甘氨酸取代，2个精氨酸残基被添加到B链的C-末端(修饰物4，图4)。甘精胰岛素的等电点向中性pH值移动，减慢了毛细血管对药物的吸收，在很大程度上降低了夜间低血糖的发生率。然而，由于该制剂显酸性，不能与其它短效制剂混合使用，并且可能在注射期间导致疼痛。后来Kurtzhals[21]在甘精胰岛素的基础上对其进行改造，将B链的C-末端截短，消除了B30处的苏氨酸残基，B29处的赖氨酸被肉豆蔻基部分酰化(修饰物5，图4)。使其不仅具有类似甘精胰岛素的药代动力学分布，而且可以配制成pH中性溶液。Kalra[22]进一步用脂肪二酸替换肉豆蔻基(修饰物6，图4)，使它在体内形成一个低聚物，这样可以大大增强药物的稳定性，使胰岛素的生物活性在体内可持续24 h。

图4 基于胰岛素序列改造的系列化合物结构Fig.4 Structures of serial compounds based on the modification of insulin sequences

2.3 基于胰岛素肽链N-末端的修饰

胰岛素的2条链各有一个N-末端，分别是甘氨酸和苯丙氨酸，此外，其内部还有一个赖氨酸。Chen等[23]通过还原胺基化或酰化来选择性地合成修饰胰岛素A链的N-末端(图 5)，B链的N-末端用Fmoc保护起来。所得到N-苄基的修饰物7和N-苯甲酰基的修饰物8具有相似的结构，但是通过HEK293细胞测量Ser473的p-Akt水平可以发现，修饰物7比修饰物8的活性高5倍，并且与HI(人胰岛素)也有相似的活性。这表明对于胰岛素N-末端的修饰是可行的。为了进一步验证该结果，将标有荧光素的胰岛素在HEK293的细胞培养物中温育30 min，然后观察到修饰物7可以结合胰岛素受体并且进入细胞，这表明该修饰不影响受体结合。虽然现在还没有对此做进一步的临床试验，但为胰岛素的N-末端修饰提供了一个生物学研究依据。

图5 胰岛素肽链N-末端的修饰Fig.5 Modification of the N-terminus of the insulin peptide chain

2.4 其它类型的修饰

研究表明，额外添加二硫键的胰岛素类似物具有更好的热稳定性和功能活性[24]。Vinther等[25]在A链的第10个氨基酸和B链的第4个氨基酸加入一个二硫键(图6)，所得到的胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力增强，并且在动物(大鼠)体内的药效动力学效能显著增强。加入二硫键之后的胰岛素类似物的熔融温度升高了34.6 ℃，并且在高物理应力下阻止了胰岛素原纤维的形成，这表明直接参与原纤维形成的B链的C-末端未被改变。重要的是，该胰岛素类似物在加入Zn2+时能够形成六聚体(六聚体形式的胰岛素更稳定)，其晶体结构与经典胰岛素的结构仅存在微小差别。

图6 胰岛素附加二硫键的结构Fig.6 Structure of insulin with additional disulfide bond

Hua等[26]通过一条多肽链(1-2：RKQLSGELALPQLSGAGPGGGLEVQGVQLDEAERR)将胰岛素2条链连接在一起(图7)。该肽链是单链前体胰岛素原的产物，其含有A链和B链连接的无序多肽序列。虽然胰岛素原保留了天然胰岛素的部分，但其活性比胰岛素低50倍。将连接肽(胰岛素原中的35个残基)切除后，激素可以通过专门的通道在含有Zn2+的六聚体中储存。六聚体在门静脉循环中解离，使激素能够作为无锌单体在血液中发挥作用。

图7 单链胰岛素的结构Fig.7 Structure of single chain insulin

3 结语

作为治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物，胰岛素的结构改造已成为当前糖尿病药物开发领域的研究热点。随着对胰岛素及其类似物构效关系的进一步阐明以及多肽合成技术的快速发展，人们通过胰岛素结构修饰必将获得高活性、低成本和稳定性强的胰岛素替代物，以便更好地造福糖尿病患者。

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ResearchProgressinStructuralModificationofInsulin

LI Xiu-zheng1,LIN Yu-hong2,DONG Jia-xiao1,YE Guang-ming3*，JIANG Yun-yun3*

(1.PLA98thClinicalCollege,AnhuiMedicalUniversity,Huzhou230032,China;2.HangzhouCONBAPharmaceuticalCo.,Ltd.,Hangzhou310051,China;3.PLA101Hospital,Wuxi214044,China)

TQ467.2

A

1672-5425(2017)09-0015-04

2017-04-09

李修政(1992-)，男，山东枣庄人，硕士研究生，研究方向：药物化学，E-mail:1826881912@qq.com；通讯作者：叶光明，副主任药师，副教授，E-mail：shygm98@163.com；姜云云，副主任药师，E-mail：20791374@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.003

李修政，林於红，董家潇，等.胰岛素结构改造的研究进展[J].化学与生物工程，2017，34(9)：15-18，23.