高效液相色谱法测定甘孜州大蒜有效成分蒜氨酸的含量

夏 陈，朱永清*，杨开俊,罗孝贵,李 娟，邓俊琳 ，张盈娇，陈 建

(1．四川省农业科学院农产品加工研究所，四川 成都 610066；2．甘孜州农业科学研究所,四川 康定 626000)

高效液相色谱法测定甘孜州大蒜有效成分蒜氨酸的含量

夏 陈1，朱永清1*，杨开俊2,罗孝贵2,李 娟1，邓俊琳1，张盈娇1，陈 建1

(1．四川省农业科学院农产品加工研究所，四川 成都 610066；2．甘孜州农业科学研究所,四川 康定 626000)

建立了高效液相色谱(HPLC)法测定大蒜中蒜氨酸含量的方法。色谱条件为：Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相A-水溶液，B-甲醇，95%B等度洗脱；检测波长214 nm。对四川省甘孜州种植的红七星、道孚、金蒜一号、曲Ⅰ4个大蒜品种进行测定，并与市售大蒜和市售独头蒜进行比较。该方法重复性好(RSD=1.95%)，稳定性好(RSD=0.90%)，精密度高(RSD=0.36%)，加标回收率较好(RSD=5.4%)。结果表明，红七星中蒜氨酸含量最高，为3.67%；道孚、金蒜一号、曲Ⅰ中蒜氨酸含量较接近，均在1.70%～1.80%；市售独头蒜中蒜氨酸含量为2.44%；市售大蒜蒜氨酸含量最低，仅为1.58%。

大蒜；蒜氨酸；高效液相色谱

Abstract：We established a high performance liquid chromatography(HPLC) method for the determination of the content of alliin from garlic.The chromatographic conditions were as follows: an Eclipse XDB-C18column (250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，mobile phase A was water，mobile phase B was methanol,95%B isocratic elution，and the detection wavelength was 214 nm.We determined the alliin contents in four kinds of garlics，namelyHongqixing，Daofu，Jinsuan1，andQuⅠ，which were planted in Garzê of Sichaun Province.We also compared their alliin contents with the common garlic and single garlic purchased in market.The method was of good repeatability(RSD=1.95%),good stability (RSD=0.90%)，high precision (RSD=0.36%),and good adding standard recovery(RSD=5.4%).Among the four kinds of garlics,Hongqixinggarlic had the highest alliin content of 3.67%.The contents of alliin inDaofu,Jinsuan1，andQuⅠgarlics were closer，and the contents ranged from 1.70% to 1.80%.The single garlic contains 2.44% alliin.The common garlic contains the lowest alliin of 1.58%.

Keywords：garlic;alliin;HPLC

大蒜(AlliumsativumL.)为百合科葱属草本植物，是重要的葱蒜类蔬菜，以鳞茎、花茎和嫩叶作为其食用器官。我国是世界大蒜种植的第一大国，产量和出口量均居世界前列[1]。大蒜营养丰富，其化学成分包括：挥发性硫醚类化合物、糖类、氨基酸类、肽类、甾体苷类、硫苷类化合物、维生素和微量元素等[2-3]。研究表明，大蒜具有抑菌[4]、防癌[2]、抗氧化[5]、护心和免疫调节[6]等多种生物功效。蒜氨酸化学名为S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-allyl-L-cysteine sulfoxide)，是大蒜中主要的含硫氨基酸[7]。蒜氨酸为大蒜的原始功效成分，在蒜氨酸裂解酶的作用下裂解产生大蒜素和阿霍烯等含硫化合物[8-9]。蒜氨酸不仅是大蒜中主要的风味前体物质[10]，且与大蒜的抗癌、抗炎症、抗糖尿病、抗菌、抗氧化[11-12]等多种生理活性有关。

蒜氨酸作为大蒜的重要功效成分以及其它功效成分的前体物质，其含量对大蒜的品质有重要影响。作者建立了高效液相色谱法(HPLC)快速检测大蒜中蒜氨酸含量的方法，并对四川省甘孜州种植的红七星、道孚、金蒜一号、曲Ⅰ4个大蒜品种，市售独头蒜和市售大蒜中的蒜氨酸含量进行定量分析，以期为大蒜中蒜氨酸的检测提供准确、可靠的快速检测方法，并为大蒜的种植及精深加工产业提供科学的质量控制参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

大蒜，由甘孜州农业科学研究所提供。

蒜氨酸标准品(纯度≥98%)，北京索莱宝科技有限公司；甲醇,色谱纯；超纯水。

电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；KH2200DE型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 蒜氨酸的提取

选取10颗完整大蒜，每颗取下3瓣，共计30瓣，称重m1；微波灭蒜氨酸酶1 min，冷却，称重m2；打浆，称取质量m3(约8 g)，加入50 mL蒸馏水，打浆，用20 mL蒸馏水洗涤打浆机，15 ℃超声提取20 min，定容至100 mL；取上清液100 μL稀释至1 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，进样5 μL，HPLC分析，检测波长为214 nm。

1.2.2 蒜氨酸标准溶液的配制

准确称取蒜氨酸标准品20 mg，置于25 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度。稀释标准品母液，分别配制浓度(μg·mL-1)梯度为1.53、6.13、12.25、19.60、49.00、98.00、196.00、392.00标准溶液，待测。

按下式计算蒜氨酸含量：

式中：c为蒜氨酸浓度。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；DAD检测器，检测波长214 nm；柱温30 ℃；流速0.8 mL·min-1；流动相：水(A)+甲醇(B)；等梯度洗脱：0～15 min，95%B。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱(图1)

图1 蒜氨酸标准品(a)和6种大蒜样品(b)的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of alliin standard(a) and six kinds of garlic samples(b)

从图1可以看出，在此色谱条件下，蒜氨酸得到较好地分离。红七星、道孚、金蒜一号、曲Ⅰ、市售独头蒜、市售大蒜在4 min处均有色谱峰(图1b)，其保留时间与蒜氨酸标准品(图1a)的色谱峰保留时间一致。

2.2 方法学验证

2.2.1 标准曲线和线性关系

在1.2.3色谱条件下分别对不同浓度的蒜氨酸标准溶液进行色谱分析。以浓度(x，μg·mL-1)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，蒜氨酸的线性方程为：y=7.2771x+17.59，R2=0.9995。表明在蒜氨酸浓度为1.53～392.00 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.2 重复性实验

按照1.2.1方法平行制备5份大蒜提取液，按1.2.3色谱条件进样5 μL进行测定，计算蒜氨酸含量的相对标准偏差(RSD)为1.95%，表明该方法重复性良好。

2.2.3 精密度实验

按照1.2.2方法制备标准溶液,按1.2.3色谱条件连续进样5次，计算蒜氨酸峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.36%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性实验

按照1.2.1方法制备1份大蒜提取液，按1.2.3色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h进样，计算蒜氨酸含量的相对标准偏差(RSD)为0.90%，表明蒜氨酸在该实验条件下8 h内稳定性良好。

2.2.5 回收率实验

按1.2.1方法制备样品，按1.2.3色谱条件进行分析，结果见表1。

表1大蒜中蒜氨酸的加标回收率

Tab.1 Adding standard recovery of the alliin in garlic

由表1可知，蒜氨酸的加标回收率在92%～104%，RSD为5.4%，表明该方法有较好的回收率。

2.3 不同品种大蒜中蒜氨酸含量

6种大蒜中蒜氨酸含量见表2。

表26种大蒜中蒜氨酸含量/%

Tab.2 Alliin contents of six kinds of garlics/%

由表2可知，红七星中蒜氨酸含量最高(3.67%)，其次为市售独头蒜(2.44%)，道孚、金蒜一号和曲Ⅰ中蒜氨酸含量较接近，均在1.70%～1.80%，含量最低为市售大蒜(1.58%)。

2.4 讨论

新鲜大蒜中蒜氨酸的提取通常对整颗大蒜随机取样，由于样本量少，导致检测结果误差大，本次实验中，随机选取10颗完整大蒜，每颗取下3瓣，共计30瓣，对这30瓣大蒜再做灭酶、打浆处理，有效降低取样误差。Huchette等[13]研究发现基因型与光照对大蒜中蒜氨酸的积累有显著影响，而温度则通过影响蔗糖浓度影响大蒜中蒜氨酸的积累。Tang等[14]报道新鲜大蒜中蒜氨酸含量约为1.29%，本实验中所测的6种大蒜中蒜氨酸含量均超过1.29%，且甘孜州种植的4种大蒜中蒜氨酸含量均高于普通市售大蒜(1.58%)。4种大蒜种植地海拔约3 700 m，昼夜温差大，日照时间长，这些气候因素可能与甘孜州大蒜中高含量蒜氨酸的形成有直接联系。红七星、道孚和金蒜一号都种植于道孚县八美镇，但红七星中蒜氨酸含量显著高于道孚和金蒜一号，这很有可能是品种差异造成的。种植于道孚县八美镇的金蒜一号和炉霍宜木乡的曲Ⅰ的蒜氨酸含量较接近，道孚县和炉霍县位于甘孜藏族自治州的西北方向，且二者毗邻，种植气候、环境无巨大差异，因此就蒜氨酸含量而言，这2种大蒜品质较接近。因此推测，红七星比道孚、金蒜一号、曲Ⅰ更适合种植于该地区，或者其品质优于其它大蒜。独头蒜是没有分瓣的大蒜，其形成的原因主要是播种的蒜瓣未经低温阶段完成春化作用而导致花芽不分化，且在鳞芽分化时缺乏足够的光照和营养物质[15]。研究发现独头蒜比大蒜中的蒜氨酸含量高5.9%[16]，本实验中市售独头蒜中蒜氨酸含量高于道孚、金蒜一号和曲Ⅰ，但远低于红七星，这也表明红七星品质较好。大蒜品质性状受到品种的遗传特性、生态环境条件、栽培技术等多方面的影响，而蒜氨酸作为大蒜中重要的功效成分，对大蒜的品质有重要影响[10]。在大蒜栽培过程中，应当重视大蒜品种、生态环境和种植条件等，以达到生产优质、高产的大蒜。

3 结论

采用HPLC法测定大蒜中蒜氨酸含量。以甲醇和水为流动相，采用等梯度洗脱的方式，较好地将蒜氨酸在15 min内进行了分离，且测定结果的重复性好(RSD=1.95%)，稳定性好(RSD=0.90%)，精密度高(RSD=0.36%)，加标回收率较好(RSD=5.4%)。测定了6种大蒜样品中蒜氨酸含量，结果表明：6种大蒜样品中蒜氨酸含量差异较大，红七星中蒜氨酸含量最高，为3.67%，道孚、金蒜一号、曲Ⅰ中蒜氨酸含量较接近，均在1.70%～1.80%，市售独头蒜中蒜氨酸含量为2.44%，市售大蒜中蒜氨酸含量为1.58%。

[1] 苏美琼,杨柏崇,成密红,等.大蒜的功效及综合利用研究进展[J].西北农业学报,2003,12(4):151-156.

[2] AMAGASE H.Clarifying the real bioactive constituents of garlic[J].The Journal of Nutrition,2006,136(3):716-725.

[3] LAWSON L D,GARDNER C D.Composition,stability,and bioavailability of garlic products being used in a clinical trial[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(16):6254-6261.

[4] ALORAINY M S.Evaluation of antimicrobial activity of garlic (Alliumsativum) againstE.coliO157:H7[J].Journal of Neurochemistry,2011,103(2):500-508.

[5] PARK J H,PARK Y K,PARK E.Antioxidative and antigenotoxic effects of garlic (AlliumsativumL.) prepared by different processing methods[J].Plant Foods for Human Nutrition,2009,64(4):244-249.

[6] KUMAR R,CHHATWAL S,ARORA S,et al.Antihyperglycemic,antihyperlipidemic,anti-inflammatory and adenosine deaminase-lowering effects of garlic in patients with type 2 diabetes mellitus with obesity[J].Diabetes Metab Syndr Obes,2013,6:49-56.

[7] CHEN Z,XU M J,WANG C,et al.Thermolysis kinetics and thermal degradation compounds of alliin[J].Food Chemistry,2017,223:25-30.

[8] BORLINGHAUS J,ALBRECHT F,GRUHLKE M C H,et al.Allicin:chemistry and biological properties[J].Molecules,2014,19(8):12591-12618.

[9] NISHIMURA H,KAWAKISHI S,NAMIKI M.Studies onγ-radiolysis of sulfur containing amino acids:part Ⅰ.γ-radiolysis ofS-n-propyl-L-cysteine sulfoxide andS-allyl-L-cysteine sulfoxide in aqueous solution[J].Agricultural and Biological Chemistry,1970,34(4):609-616.

[10] HORNICKOVA J,KUBEC R,CEJPEK K,et al.Profiles ofS-alk (en) ylcysteine sulfoxides in various garlic genotypes[J].Czech Journal of Food Sciences,2010,28(4):298-308.

[11] LANZOTTI V,SCALA F,BONANOMI G.Compounds fromAlliumspecies with cytotoxic and antimicrobial activity[J].Phytochemistry Reviews,2014,13(4):769-791.

[12] KHANUM F,ANILAKUMAR K R,VISWANATHAN K R.Anticarcinogenic properties of garlic:a review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2004,44(6):479-488.

[13] HUCHETTE O,KAHANE R,AUGER J,et al.Influence of environmental and genetic factors on the alliin content of garlic bulbs[C]//Ⅳ International Symposium on Edible Alliaceae 688.2004:93-100.

[14] TANG H,CHEN J.Internal standard HPLC determination of alliin from fresh garlic[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis,2007,27(9):1444-1447.

[15] 张愚,毛啓明.大蒜形态发育的初步研究[J].园艺学报,1963,2(3):283-293.

[16] 谭志静.HPLC 测定独头蒜和大蒜中的蒜氨酸和大蒜素[J].现代农业,2007(5):87-88.

DeterminationofEffectiveComponentAlliinfromGarlicPlantedinGarzêbyHPLC

XIA Chen1,ZHU Yong-qing1*,YANG Kai-jun2,LUO Xiao-gui2,LI Juan1,DENG Jun-lin1,ZHANG Ying-jiao1,CHEN Jian1

(1.InstituteofAgro-ProductsProcessingScienceandTechnology,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Chengdu610066,China；2.GarzêAgriculturalResearchInstitute,Kangding626000,China)

O657.72

A

1672-5425(2017)09-0067-04

四川省财政创新能力提升工程，四川省农科院条件建设专项-院人才项目

2017-05-05

夏陈(1983-)，男，四川成都人，助理研究员，研究方向：功能食(药)品，E-mail:154541462@qq.com；通讯作者：朱永清，副研究员，E-mail:137124551@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.015

夏陈，朱永清，杨开俊，等.高效液相色谱法测定甘孜州大蒜有效成分蒜氨酸的含量[J].化学与生物工程，2017，34(9)：67-70.