响应曲面法优化陕产瞿麦中总黄酮的微波辅助提取工艺

2017-10-16郑丽娟崔建强

化学与生物工程 2017年9期

关键词：黄酮微波乙醇

张爽，胡宏，郑丽娟，王燕，崔建强

(陕西国际商贸学院医药学院，陕西西安 712046)

响应曲面法优化陕产瞿麦中总黄酮的微波辅助提取工艺

张爽，胡宏，郑丽娟，王燕，崔建强

(陕西国际商贸学院医药学院，陕西西安 712046)

以陕西眉县的瞿麦为研究对象，以乙醇为提取剂，采用微波辅助提取工艺提取瞿麦中总黄酮。在单因素实验的基础上，以总黄酮得率为评价指标，采用响应曲面法确定最佳工艺为：料液比1∶20(g∶mL)、提取时间2 min、乙醇体积分数60%，在此条件下，重复3次平行实验，总黄酮得率为1.113%，与模型预测值基本吻合，说明模型能较好预测陕产瞿麦中总黄酮得率，优化工艺条件较可靠。

陕产瞿麦；总黄酮；响应曲面法；微波辅助提取

Abstract：UsingDianthussuperbusfrom Mei county in Shaanxi as a research object，ethanol as an extractant,we extracted total flavonoids fromDianthussuperbusby microwave-assisted extraction process.On the basis of the single-factor experiment，using the yield of total flavonoids as an index,we optimized the extraction conditions by a response surface methodology as follows:solid-liquid ratio was 1∶20(g∶mL),extraction time was 2 min，and volume fraction of ethanol was 60%.Under above conditions，the yield of total flavonoids for three parallel experiments was 1.113%,which approximately agreed with the model prediction value.Overall，the model can better predict the yield of total flavonoids from ShaanxiDianthussuperbus,and the optimized extraction process is more reliable.

Keywords：ShaanxiDianthussuperbus;total flavonoids;response surface methodology;microwave-assisted extraction

瞿麦又名野麦、石柱花、十样景花等，为石竹科石竹属植物瞿麦DianthussuperbusL.的干燥地上部分，在我国东北、华北、西北(如陕西的太白山)地区分布广泛。瞿麦是我国常用的传统中药，在历版中国药典中均有记载，其性味苦、寒，具有清热利水、破血通经之功效，主治小便不通、热淋、血淋、砂石淋、目赤肿痛、经闭等症[1]，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、免疫调节等多种药理活性[2-4]。瞿麦中主要活性成分有皂苷类、环肽类、黄酮类、多糖等[5-6]。其中，黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇痛等作用，同时对心脑血管疾病有较好的疗效。目前关于瞿麦中总黄酮的提取研究较少。基于此，作者以陕西眉县的瞿麦为研究对象，采用单因素实验和响应曲面法实验优化瞿麦中总黄酮的提取条件，拟为进一步开发利用陕产瞿麦资源以及新药研发提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

瞿麦，购自陕西省眉县药材总公司，经陕西国际商贸学院生药教研室雷国莲教授鉴定为石竹科植物瞿麦的带花全草。

芦丁标准品，中国食品药品检定研究院；无水乙醇，分析纯，天津河东区红岩试剂厂；亚硝酸钠，分析纯，郑州天之昊化工产品有限公司；氢氧化钠，分析纯，上海永叶生物科技有限公司。

XH100B型微波萃取仪，北京详锆发展有限公司；FW100型高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；FA1104型电子分析天平，天津鑫博得仪器有限公司；UV2400型紫外分光光度计，天津精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

标准溶液的配制：精密称取芦丁标准品0.0109 g，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，摇匀后备用。

供试品溶液的配制：将瞿麦置于高速万能粉碎机中粉碎，过40目筛。精密称取瞿麦粉末7 g，置于锥形瓶中，按一定料液比加入乙醇，称重，于一定功率下微波处理一定时间，再称重，用乙醇补足。抽滤，弃药渣，置于50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀。

1.2.2 检测波长的确定

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定标准品和供试品在420～700 nm波长范围内的吸光度，发现在506 nm处有最大吸收，故以506 nm作为检测波长。

1.2.3 标准曲线的绘制

精密量取芦丁标准品溶液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，分别置于25 mL 容量瓶中，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置5 min；加入1 mL 10%硝酸铝溶液,摇匀，放置6 min；加入10 mL 4%氢氧化钠溶液，用80%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 min。测定506 nm处吸光度。以芦丁标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 总黄酮得率的测定

精密量取供试品溶液，按1.2.3方法测定其吸光度，根据拟合的线性回归方程计算陕产瞿麦中总黄铜含量，按下式计算总黄铜得率：

提取液中总黄酮含量(以芦丁计，mg)=

1.3 提取工艺优化

1.3.1 单因素实验

选择料液比、提取时间、微波功率、乙醇体积分数为考察因素,研究各因素对瞿麦中总黄酮得率的影响。

1.3.2 响应曲面法实验

应用 Design-Expert 8.0.6软件,以料液比、提取时间和乙醇体积分数为自变量，以总黄酮得率为响应值，采用Box-Behnken实验设计3因素3水平的响应曲面法实验，研究各影响因素之间的交互作用，拟合出多元二次回归模型并进行方差分析，最终确定瞿麦中总黄酮的最佳提取工艺。因素与水平见表1。

表1Box-Behnken实验的因素与水平

Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线

拟合标准曲线的线性回归方程为y=11.592x-0.0426，相关系数R2=0.9966，芦丁在0.02～0.06 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对总黄酮得率的影响

称取瞿麦粉末7 g，在微波功率为600 W、乙醇体积分数为60%、提取温度为50 ℃、提取时间为2 min的条件下，考察料液比对总黄铜得率的影响，结果见图1。

图1 料液比对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids yield

由图1可知，总黄酮得率随溶剂用量的增加先升高后降低，在液料比为1∶20时总黄酮得率最高。这是因为，在相同的微波加热时间内，体系的溶剂量大，温度就比较低，溶质在溶剂中的扩散受到影响，提取率相应较低。所以选择料液比为1∶20较为适宜。

2.2.2 提取时间对总黄酮得率的影响

在其它条件同2.2.1、料液比为1∶20的条件下，考察提取时间对总黄酮得率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on total flavonoids yield

由图2可知，总黄酮得率随着提取时间的延长先升高后降低，在提取时间为2 min时总黄酮得率最高。这可能是由于，微波产生的热量长时间作用于瞿麦，破坏了某些热敏性黄酮类成分，导致总黄酮得率降低。所以选择提取时间为2 min较为适宜。

2.2.3 微波功率对总黄酮得率的影响

在其它条件同2.2.1、料液比为1∶20的条件下，考察微波功率对总黄酮得率的影响，结果见图3。

图3 微波功率对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on total flavonoids yield

由图3可知，微波功率对总黄酮得率的影响较为平缓，总黄酮得率随着微波功率的增大先升高后降低，在微波功率为600 W时总黄酮得率最高。这可能是由于，微波功率较大使瞿麦中某些黄酮类成分遭到破坏，导致总黄酮得率有所下降。所以选择微波功率为600 W较为适宜。

2.2.4 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

在其它条件同2.2.1、料液比为1∶20的条件下,考察乙醇体积分数对总黄酮得率的影响，结果见图4。

图4 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of volume fraction of ethanol on total flavonoids yield

由图4可知，总黄酮得率随着乙醇体积分数的增大先升高后降低，在乙醇体积分数为60%时总黄酮得率最高。所以选择乙醇体积分数为60%较为适宜。

2.3 响应曲面法实验结果

2.3.1 Box-Behnken实验结果(表2)

表2Box-Behnken实验结果

Tab.2 Results of Box-Behnken experiment

2.3.2 模型方差分析及显著性检验(表3)

表3模型的方差分析及显著性检验

Tab.3 Variance analysis and significance test of model

注：**表示P<0.01，极显著。

对模型中所有影响因素分析可知，A、B、AB、BC、A2、B2、C2对总黄酮得率影响极其显著。一次项中各因素对总黄酮得率的影响显著性大小依次为：料液比(A)>提取时间(B)>乙醇体积分数(C)。拟合后得到关于液料比、提取时间、乙醇体积分数对总黄酮得率(Y)的二次多项式回归方程为：Y=1.12+0.051A+0.050B+8.000×10-3C+0.062AB+0.018AC+0.046BC-0.20A2-0.18B2-0.18C2。2.3.3 各因素交互作用的响应面图和等高线图(图5)

a.料液比和提取时间的交互作用 b.料液比和乙醇体积分数的交互作用 c.提取时间和乙醇体积分数的交互作用陕产瞿麦中总黄酮得率与对应的料液比(A)、提取时间(B)、乙醇体积分数(C)构成一个三维空间的曲面图，曲线越陡峭，等高线形状越趋向椭圆且椭圆轴线与坐标轴的曲线越大，则交互作用越显著。

图5各因素交互作用的响应面图和等高线图
Fig.5Responsesurfaceandcontouroftheinteractionbetweenthreefactors

从图5a可以看出，曲线有较大的变化曲度，说明总黄酮得率受料液比和提取时间的影响均较大，随着料液比的增大和提取时间的延长，总黄酮得率呈先上升后下降的趋势。从等高线可以看出，等高线为椭圆形，因此，料液比和提取时间的交互作用显著，与方差分析结果一致。当料液比为1∶20、提取时间为2 min时，总黄酮得率较高。

从图5b可以看出，料液比对总黄酮得率影响的曲线较乙醇体积分数对总黄酮得率的影响的曲线更陡峭，因此，料液比对总黄酮得率的影响相对于乙醇体积分数对其影响更显著，并随着料液比的增大总黄酮得率呈先上升后下降的趋势。当料液比为1∶20、乙醇体积分数为60%时，总黄酮得率较高。

从图5c可以看出，提取时间对总黄酮得率影响的曲线较乙醇体积分数对总黄酮得率影响的曲线更陡峭，因此，提取时间对陕产总黄酮得率的影响相对于乙醇体积分数对其影响更显著，并随着提取时间的延长总黄酮得率呈先上升后下降的趋势。从等高线可以看出，等高线为椭圆形，因此，可判断料液比和乙醇体积分数的交互作用显著，与方差分析结果一致。当提取时间为2 min、乙醇体积分数为60%时，总黄酮得率较高。

2.3.4 最佳工艺条件的确定及验证实验

利用Design-Expert 8.0.6软件进行工艺参数的优化组合，得到瞿麦中总黄酮的最佳提取工艺为：料液比1∶20.79、提取时间2.18 min、乙醇体积分数60.53%，此时总黄酮得率最高，达到1.126%。为验证模型的有效性，考虑到实际情况,将最佳工艺条件修正为：料液比1∶20、提取时间2 min、乙醇体积分数60%，在此工艺条件下，重复3次平行实验，总黄酮得率为1.113%，与模型预测值基本吻合，说明模型能较好预测陕产瞿麦中总黄酮得率，优化工艺条件较可靠。