儿童呼吸道分离流感嗜血杆菌的耐药性和基因分型

秦惠宏， 王 春， 潘 芬， 刘昌颀， 赵克温， 张 泓

儿童呼吸道分离流感嗜血杆菌的耐药性和基因分型

秦惠宏1，2， 王 春2， 潘 芬2， 刘昌颀2， 赵克温1， 张 泓2

目的研究儿童呼吸道分离流感嗜血杆菌的耐药性和该菌ftsI基因分型与耐药表型的关系。方法收集2016年第一季度住院患儿鼻咽吸出物中分离到的流感嗜血杆菌141株；用纸片扩散法检测细菌对抗菌药物的耐药性；用Nitroce fi n纸片法检测细菌的β内酰胺酶； 用PCR技术对分离菌株进行ftsI基因检测；比较不同基因型菌株对抗菌药物的耐药情况。结果141株流感嗜血杆菌β 内酰胺酶检出率为40.4%（57/141）、氨苄西林耐药率为53.2%（75/141）。检出ftsI基因突变率为72.3%（102/141），以Ⅲ型为主（72/102，70.6%）。β 内酰胺酶基因阴性氨苄西林耐药型菌株（gBLNAR）对氨苄西林和头孢呋辛的耐药率高于β 内酰胺酶基因阴性氨苄西林敏感型菌株（gBLNAS）（P＜0.05）。结论儿童呼吸道分离流感嗜血杆菌ftsI基因突变率高，以Ⅲ型为主。ftsI基因突变增加了流感嗜血杆菌对氨苄西林和头孢呋辛的耐药性。

流感嗜血杆菌； 耐药性；ftsI基因

Abstract: ObjectiveTo investigate the antibiotic resistance pro fi le andftsIgenotypes ofHaemophilus in fluenzaeisolates from respiratory tract in children.MethodsA total of 141 consecutive nonduplicate clinical strains ofH. in fluenzaewere collected from January to March 2016. Antimicrobial susceptibility was determined using Kirby-Bauer method. Beta-lactamase production was detected by nitroce fin disk test. PCR technique was employed forftsIgenotyping. Antimicrobial resistance was compared between differentftsIgenotypes.ResultsThe prevalence of β-lactamases was 40.4% (57/141) inH. influenzaeisolates. More than half(53.2%, 75/141) of the strains were resistant to ampicillin. Mutation offtsIgene was positive in 72.3% (102/141) of the isolates. The dominant genotype of genomic beta-lactamase-negative ampicillin-resistant (gBLNAR) strains was type III (72/102, 70.6%). The gBLNAR strains showed higher resistance rate to ampicillin and cefuroxime than the genomic beta-lactamase-negative ampicillinsusceptible (gBLNAS) strains (P＜0.05).ConclusionsHigh prevalence offtsIgene mutation is found in the strains ofH. in fl uenzaeisolated from respiratory tract in children. The dominant genotype of gBLNAR strains was type III. Mutation offtsIgene inH.in fluenzaeis associated with higher resistance rate to ampicillin and cefuroxime.

Key words:Haemophilus in fluenzae; antimicrobial resistance;ftsIgene

流感嗜血杆菌是引起社区获得性感染的重要病原体，可引起社区获得性呼吸道感染、肺炎、支气管炎、急性中耳炎、细菌性脑膜炎等疾病[1]。口服的氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸和静脉输注的头孢噻肟、头孢曲松是临床上感染流感嗜血杆菌患儿首选药物。随着β内酰胺类抗生素的广泛使用，其耐药率也逐年递增。本研究对呼吸道感染患儿呼吸道分离的流感嗜血杆菌进行耐药性分析和ftsI基因检测，明确儿童呼吸道分离流感嗜血杆菌的耐药情况、ftsI基因分型，比较不同基因型菌株对抗菌药物的耐药情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株来源 收集2016年第一季度上海市儿童医院住院患儿鼻咽吸出物分离到的流感嗜血杆菌141株，剔除同一患者同次住院重复分离株。

1.1.2培养基、抗菌药物纸片和药敏培养基 用上海科玛嘉微生物技术有限公司的HTM 平皿。抗菌药物纸片氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、阿奇霉素、氯霉素、环丙沙星、头孢噻肟、头孢呋辛、氨苄西林-舒巴坦、甲氧苄啶-磺胺甲唑均为英国OXOID公司产品。

1.1.3PCR扩增试剂 日本TaKaRa公司产品。

1.1.4引物合成 参考文献[2]和GenBank中相关基因序列。针对流感嗜血杆菌特异性外膜蛋白P6基因设计引物P6，用于确认菌株为流感嗜血杆菌，针对流感嗜血杆菌的TEM-1型β 内酰胺酶基因设计引物TEM-1，针对无Asn-526-Lys氨基酸置换的ftsI基因设计引物PBP3-S，针对同时存在Asn-526-Lys和Ser-385-Thr氨基酸置换的ftsI基因设计引物PBP3-BLN，由上海生物工程技术有限公司合成，引物序列及产物长度见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used in PCR

1.1.5主要仪器 -80 ℃和-20 ℃冰箱（海尔，山东青岛），干式恒温器GL-150B（其林贝尔，江苏海门），高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17（Thermo，美国），PCR扩增仪Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler（ABI， 美 国 ）， 成 像 系 统BIO-RAD Gel DocXR+（Bio-Rad，美国）。

1.2 方法

1.2.1菌株的分离培养和鉴定 巧克力平皿上挑取可疑菌落，密涂于TSA平皿，贴上Ⅴ﹑Ⅹ和Ⅴ+Ⅹ因子，同时需要Ⅴ因子和Ⅹ因子才能生长的为流感嗜血杆菌。用厦门质谱仪器仪表有限公司生产的Microtype MS微生物快速鉴定系统进行鉴定确认流感嗜血杆菌。

1.2.2药敏试验 采用美国临床和实验室标准化协会（CLSI）推荐的纸片扩散法。质控菌株为流感嗜血杆菌ATCC49247。药敏试验结果按CLSI 2015年版M100-25标准判断。采用Nitroce fi n纸片检测流感嗜血杆菌中的β 内酰胺酶。

1.2.3细菌DNA模板的制备 采用煮沸法提取流感嗜血杆菌的DNA。取流感嗜血杆菌混匀0.9%NaCl 0.5 mL，浓度高于1麦氏单位，制备悬液。悬液于加热器中100 ℃加热10 min，冷却后置于高速离心机，离心力13 800 g，离心1 min，取上清液，即为DNA模板，-20 ℃保存。

1.2.4PCR扩增 反应总体积50 μL，包括10 mmol/L dNTP 4 μL，10×buffer 5 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模版 2.5 μL，无菌去离子水35.5 μL。扩增条件：94 ℃预变性10 min，随后 94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环30次，最后72 ℃再延伸10 min。

1.2.5琼脂糖凝胶电泳 取PCR产物5 μL，与1 μL含溴酚蓝的loading buffer点样液混匀，加到含GelRed核酸染料的2%琼脂糖凝胶点样孔中，电场强度3 V/cm，电泳35 min后，紫外灯下判读结果，并保存凝胶成像。

1.2.6流感嗜血杆菌基因分型 根据流感嗜血杆菌的bla基因以及ftsI基因，将其分为4种基因型。其中，β内酰胺酶基因阴性氨苄西林耐药菌株（gBLNAR）和β 内酰胺酶基因阳性阿莫西林-克拉维酸耐药株（gBLPACR）又根据ftsI基因不同的氨基酸置换分成不同的亚型，见表2。

表2 流感嗜血杆菌基因型Table 2 Genotypes ofHaemophilus in fl uenzae

1.2.7统计学分析 应用WHONET5.6和SPSS19.0软件对数据进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流感嗜血杆菌的β内酰胺酶基因（bla）检出率及对抗菌药物的敏感性

141株流感嗜血杆菌中β 内酰胺酶检出率为40.4%（57/141）。产酶株均检测到TEM-1型bla基因。根据流感嗜血杆菌是否产β 内酰胺酶，分别分析其对9种抗菌药物的耐药性。β 内酰胺酶阳性菌株对抗菌药物耐药率均高于β 内酰胺酶阴性菌株。产酶流感嗜血杆菌对氨苄西林、阿奇霉素耐药率高于非产酶株（P＜0.05），见表3。

表3 流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility ofHaemophilus in fl uenzaestrains in terms of β-lactamase status（%）

2.2 流感嗜血杆菌的ftsI基因分型

141株流感嗜血杆菌中，102株（72.3%）发生ftsI基因突变。102株突变株中，ftsI基因上发生 Asn-526-Lys（N526K）无 Ser-385-Thr（S385T）氨基酸置换，即Ⅱ型的比率为29.4%（30/102），同时发生Asn-526-Lys和Ser-385-Thr氨基酸置换（N526K+S385T），即Ⅲ型的比率为 70.6%（72/102）。

2.3 表型β 内酰胺酶阴性氨苄西林耐药（BLNAR）流感嗜血杆菌的ftsI 基因突变检出情况

18株BLNAR均检出ftsI基因突变，其中15株为Ⅲ型，3株为Ⅱ型。

2.4 流感嗜血杆菌的基因分型和对抗菌药物的敏感性

2.4.1流感嗜血杆菌的基因分型 141株流感嗜血杆菌中，β 内酰胺酶基因阴性氨苄西林敏感（gBLNAS）占13.5%（19/141），gBLNAR（Ⅱ）占12.1%（17/141），gBLNAR（Ⅲ）占34.0%（48/141），β 内酰胺酶基因阳性氨苄西林耐药（gBLPAR）占14.2%（20/141），gBLPACR（Ⅱ）占9.2%（13/141），gBLPACR（Ⅲ）占17.0%（24/141）。电泳分型图，见图1。

图1 流感嗜血杆菌β 内酰胺酶基因和ftsI基因结合分型Figure 1 Genotype ofHaemophilus in fl uenzaebased on bothblaandftsIgenes

2.4.2不同基因型别流感嗜血杆菌耐药性分析 gBLNAR对氨苄西林和头孢呋辛的耐药率高于gBLNAS菌株（P＜0.05）， 对其余抗菌药物gBLNAR和gBLNAS流感嗜血杆菌的耐药率差异无统计学 意 义（P＞0.05），gBLNAR（ Ⅲ ） 与 gBLNAR（Ⅱ）菌株对氨苄西林的耐药率差异无统计学意义（P＞ 0.05），gBLNAR（Ⅲ） 对头孢呋辛的耐药率高于gBLNAR（Ⅱ）菌株（P＜0.05），见表4。

表4 流感嗜血杆菌不同基因型对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 4 Susceptibility ofHaemophilus in fl uenzaestrains in terms ofblagene andftsIgene mutation

3 讨论

流感嗜血杆菌对β 内酰胺类抗生素的耐药机制主要有2种，一种是产β内酰胺酶（TEM-1型或ROB-1型），水解氨苄西林使其失活，这种耐药机制导致氨苄西林耐药称β 内酰胺酶阳性氨苄西林耐药（BLPAR）流感嗜血杆菌；另一种是ftsI基因氨基酸位点突变引起青霉素结合蛋白（PBP）空间构象的改变，使其对氨苄西林亲和力下降，这种耐药机制导致氨苄西林耐药称BLNAR流感嗜血杆菌。两种机制同时出现导致阿莫西林-克拉维酸耐药的菌株称β 内酰胺酶阳性阿莫西林-克拉维酸耐药（BLPACR）流感嗜血杆菌[1]。1972年在欧洲首次报道氨苄西林耐药，其耐药机制是产β内酰胺酶。1980年首株BLNAR菌株被报道。ftsI基因有28种不同的突变模式和23个氨基酸置换位点。在抗菌药物的选择压力下，流感嗜血杆菌的PBP3会发生两种主要的适应性改变[3]：一种是在KTG基序附近发生氨基酸置换，如发生Arg517His和Asn526Lys置换。另一种是在SSN基序附近发生氨基酸置换，如发生Met377Ile、Ser385Thr和Leu389Phe置换。根据不同位点的氨基酸置换，Ubukata等[1]将流感嗜血杆菌分为3型：Ⅰ型，在KTG基序附近发生Arg517His置换；Ⅱ型，在KTG基序附近发生Asn526Lys置换；Ⅲ型，在KTG基序附近发生Asn526Lys置换同时，在SSN基序附近发生Met377Ile、Ser385Thr和（或）Leu389Phe置换 。此次研究141株流感嗜血杆菌中，72.3%（102/141）发生ftsI基因突变。ftsI基因分型中，以Ⅲ型为主，占70.6（72/102），Ⅱ型占29.4%（30/102）。与葡萄牙、巴塞罗那等欧洲国家和地区以Ⅱ型为主不一致[4-5]。值得关注的是谢成彬等[6]报道了我国2011－2012年成都地区流感嗜血杆菌ftsI基因分型以Ⅰ/Ⅱ型为主，与本次研究以Ⅲ型为主不同，一种可能是由于地域不同，首选用药习惯不同引起不同的ftsI基因突变，另一种可能是随时间推移，ftsI基因突变有所改变。

本研究中，141株流感嗜血杆菌β 内酰胺酶检出率（40.4%），氨苄西林耐药率（53.2%），BLNAR菌株检出率（12.8%），头孢呋辛耐药率（32.6%），阿奇霉素非敏率（30.5%），分别较2012年本院各数据36.6%、44.7%、12.7%、14.6%、5.9%[7]均有增加，BLNAR菌株检出平稳。氨苄西林耐药率高，不建议作为治疗流感嗜血杆菌感染首选药物。头孢呋辛的耐药率和阿奇霉素的非敏率明显升高，可能与儿童患者用药种类有限，将阿奇霉素和头孢呋辛作为儿童呼吸道感染的常用药物有关[8]。β 内酰胺酶阳性菌株对抗菌药物耐药率均高于β 内酰胺酶阴性菌株，表明产β 内酰胺酶是流感嗜血杆菌对各种抗菌药物耐药性增加的主要原因。产酶流感嗜血杆菌对氨苄西林、阿奇霉素耐药率高于非产酶株（P＜0.05）。氨苄西林属于β 内酰胺类抗生素，流感嗜血杆菌产β 内酰胺酶而耐药。阿奇霉素属于大环内酯类抗菌药物，流感嗜血杆菌对这类抗生素耐药可由先天或获得性外排泵、核糖体甲基化及核糖体蛋白和RNA的变异引起[9]，和细菌产酶是否有关，具体有待进一步研究。谢成彬等[6]对2011－2012年成都地区473株流感嗜血杆菌研究发现非产酶流感嗜血杆菌的ftsI基因突变对氨苄西林和第二代头孢菌素影响较大，对第三代头孢菌素影响较小，对非β 内酰胺类抗菌药物影响很小，ftsI基因SSN基序的突变比KTG基序的突变更显著地降低细菌对头孢菌素敏感性。本研究中，gBLNAR对氨苄西林的耐药率高于gBLNAS（P＜0.05），gBLNAR（Ⅲ）和gBLNAR（Ⅱ）对氨苄西林的耐药率差异无统计学意义（P＞ 0.05），说明非产β 内酰胺酶流感嗜血杆菌中ftsI基因KTG基序上N526K突变增加其对氨苄西林耐药性，SSN基序上S385T突变对氨苄西林耐药性影响不大。gBLNAR对头孢呋辛的耐药率高于 gBLNAS（P＜0.05），gBLNAR（Ⅲ） 对头孢呋辛耐药率高于gBLNAR（Ⅱ）（P＜0.05），说明非产β 内酰胺酶流感嗜血杆菌中ftsI基因KTG基序上N526K突变对头孢呋辛耐药性影响不大，SSN基序上S385T突变增加其对头孢呋辛耐药性，与谢成彬等[6]报道基本一致。gBLNAR和gBLNAS对非β 内酰胺类抗菌药物（阿奇霉素、氯霉素、环丙沙星、甲氧苄啶-磺胺甲唑）和第三代头孢菌素（头孢噻肟）的耐药率差异均无统计学意义（P＞0.05），说明非产β 内酰胺酶流感嗜血杆菌中ftsI基因突变对非β 内酰胺类抗菌药物和第三代头孢菌素几乎无影响。另外，gBLNAS中有6株流感嗜血杆菌氨苄西林中介，可能存在此次研究中未涉及到的Arg517His 、Met377Ile、Ser385Thr或Leu389Phe氨基酸置换。法国、瑞士、德国等西方国家流感嗜血杆菌BLNAR的ftsI基因分型以Ⅱ型为主，Ⅲ型少见[8，10-11]。韩国2010年流感嗜血杆菌BLNAR的ftsI基因分型以Ⅱ型为主[12]。日本2007－2012年304株BLNAR中均发生ftsI基因突变，其中Ⅰ型8.2%，Ⅱ型9.5%，Ⅲ型占81.6%[13]。本次研究18株BLNAR中均检出ftsI基因突变，其中15株为Ⅲ型， 3株Ⅱ型，BLNAR的ftsI基因突变以Ⅲ型为主，与日本报道一致。

综上所述，由于流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率高，不建议该药作为治疗流感嗜血杆菌感染的首选药物。流感嗜血杆菌发生ftsI基因突变较常见，以Ⅲ型为主，突变增加了氨苄西林和头孢呋辛耐药率。关注流感嗜血杆菌的分离培养、对抗菌药物的耐药性和耐药机制，有助于临床合理用药，延缓细菌耐药性产生。

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Antimicrobial resistance pro file and genotypes of Haemophilus in fluenzae isolates from respiratory tract in children

QIN Huihong, WANG Chun, PAN Fen, LIU Changqi, ZHAO Kewen, ZHANG Hong. （Department of Pathophysiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China）

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0532-06

10.16718/j.1009-7708.2017.05.009

2017-02-13

2017-05-12

上海市卫计委重要薄弱学科建设（2015ZB0203）。

1. 上海交通大学医学院基础医学院病理生理学教研室，上海 200025；

2. 上海交通大学附属儿童医院检验科。

秦惠宏（1985—），女，学士，主管技师，主要从事细菌耐药性研究。

赵克温，E-mail： zkewen@sjtu.edu.cn。