老年大鼠学习记忆相关基因egr1表达变化的机制及补肾益气方药的调整作用

尹 芳 郑 静 康湘萍 张丽娜 金国琴

(上海中医药大学基础医学院生化教研室，上海 201203)

·基础研究·

老年大鼠学习记忆相关基因egr1表达变化的机制及补肾益气方药的调整作用

尹 芳 郑 静 康湘萍 张丽娜 金国琴

(上海中医药大学基础医学院生化教研室，上海 201203)

目的探讨DNA甲基化老年大鼠学习记忆相关基因egr1表达变化的机制及补肾益气方药——左归丸、益气聪明汤的调整作用。方法以自然衰老(24月龄)SD雄性大鼠为动物模型，随机分为老年对照组、老年补肾组、老年益气组、老年合剂组和老年拮抗组，另设一组青年对照组(5月龄)。采用RT-PCR法及Western印迹法观察大鼠学习记忆相关基因egr1 mRNA和蛋白表达变化，采用亚硫酸氢盐转化结合高通量测序法检测基因egr1启动子区甲基化状态，同时观察补肾益气方药对上述指标变化的调整作用。结果与青年对照组相比，老年大鼠egr1 基因mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05)，其启动子区甲基化增高，左归丸、益气聪明汤能不同程度地改善egr1的表达，并降低egr1启动子区甲基化率。结论补肾益气方药改善老年大鼠增龄性学习记忆退化可能与抑制基因egr1启动子DNA甲基化而提高egr1的表达有关。

egr1；DNA甲基化；左归丸；益气聪明汤

egr1是早期生长反应egr基因家族的一员，编码的核转录因子对突触重塑和记忆以及长时程增强效应(LTP)的诱导起到重要作用〔1〕。敲除egr1的小鼠海马可观察到短期LTP现象，且持续性LTP受损〔2〕；空间学习记忆实验中，egr1缺失的小鼠具有完整的短期记忆但长期记忆缺失。Renaudineau等〔3〕研究表明，海马中egr1是维持空间记忆长期稳定所必须的，而老年大鼠缺失这一过程〔4〕。目前，对增龄性相关基因转录变化的机制还不清楚，但有研究表明，突触重塑和记忆形成过程中DNA甲基化与组蛋白乙酰化的动态调节影响相关基因的转录〔5〕。越来越多的证据表明，老年大脑中的表观遗传变化影响增龄性相关的认知功能〔6～8〕。例如，活性调节细胞骨架基因(arc)是记忆相关基因，其转录因增龄而发生改变，这与arc基因的异常甲基化有关〔6〕。最近有研究发现，老年动物海马bdnf和egr1核小体组蛋白赖氨酸残基甲基化水平异常〔8〕。本实验在以往补肾益气方药改善老年大鼠学习记忆退化的实验基础上〔9〕，着重观察补肾益气对大鼠海马组织中egr1 mRNA和蛋白表达的影响及egr1 DNA启动子区甲基化状态的变化。

1 材料与方法

1.1实验方药 左归丸出自《景岳全书》原方，由熟地黄20 g、山药10 g、菟丝子10 g、枸杞子10 g、山茱萸10 g、牛膝7.5 g、龟板胶10 g、鹿角胶10 g组成；益气聪明汤出自《东垣试效方·卷五》，由黄芪15 g、炙甘草15 g、人参15 g、升麻9 g、葛根9 g、蔓荆子4.5 g、芍药3 g、黄柏3 g组成，以上药物均购自上海康桥中药饮片有限公司。将各方药按传统方法水煎成剂，并加以浓缩，-30℃保存，临用前稀释；合剂以稀释后的左归丸药液与益气聪明汤药液等体积混合后饮用。

1.2试剂与仪器 Trizol(Invitrogen公司)，egr1兔抗大鼠多克隆抗体(Abcam公司)，β-actin 兔抗大鼠多克隆抗体(CST公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(CST公司)，PrimeScriptTM RT Kit(TaKaRa公司)，SYBR Premix Ex TaqTM Kit(TaKaRa公司)，Genomic DNA-issue MiniPrep(ZYMO公司)，DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO公司)，RU38486(Sigma公司)，引物合成(上海英潍捷基公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Milipore公司)，PCR仪(Eppendorf公司)，RT-PCR仪(ABI公司)，蛋白电泳仪、电泳槽、转移槽(Bio-Rad公司)，凝胶成像分析系统(GBOX CHEMI)，测序(上海英潍捷基公司)。

1.3实验动物造模及分组 12月龄清洁级、雄性SD大鼠，上海中医药大学实验动物中心提供，随机分为老年对照组、老年补肾组、老年益气组、老年合剂组及老年拮抗组，另设青年对照组(5月龄)。自21月龄起，分别给老年补肾组、老年益气组及老年合剂组大鼠饮用左归丸、益气聪明汤及两方合剂药液(剂量相当于临床成人每公斤体重剂量的9倍)，连续应用3个月至24月龄，每周饮药液5 d、停药2 d；老年拮抗组于取样前连续7 d皮下注射皮质酮拮抗剂RU38486(5 mg/kg)〔10〕。

1.4方法

1.4.1egr1 mRNA表达检测 Trizol试剂提取大鼠海马总RNA，测定OD260/OD280比值，琼脂糖凝胶电泳判断所提取RNA的纯度和完整性；测定RNA浓度后分装，-30℃保存待用。逆转录生成cDNA及RT-PCR反应参照试剂盒说明书进行，采用两步法，热循环参数：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。实验结果采用ΔΔCt法分析。

1.4.2Western印迹法检测egr1蛋白表达 分离大鼠海马、提取蛋白，双缩脲法定量蛋白，取上清液分装，-80℃保存。依次进行上样、电泳、转膜、封闭及发光检测，一抗的稀释比例为1∶200，二抗的稀释比例为1∶20 000，化学增强发光法(ECL)显色后凝胶成像分析系统直接成像、拍照，求得积分密度值(IOD)。

1.4.3高通量测序法检测egr1启动子区甲基化水平 分离大鼠海马、提取基因组DNA，组内6个样本的基因组DNA合并为1个样本。按照试剂盒说明书对DNA进行亚硫酸氢钠转化，非甲基化状态的胞嘧啶C被转化为尿嘧啶U，甲基化状态的胞嘧啶C不会被转化。UCSC数据库在线预测egr1基因启动子区CpG岛，设计引物对egr1启动子区包含CpG岛的一段DNA(该DNA片段包含5个CG位点)进行测序。

1.5统计学方法 应用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1补肾益气方药对老年大鼠egr1 mRNA表达的影响 与青年对照组(0.991±0.011)比较，老年对照组大鼠海马组织egr1基因mRNA表达(0.322±0.025)明显降低(P<0.05)；与老年对照组相比，老年补肾组、老年益气组、老年合剂组和老年拮抗组(0.600±0.044、0.543±0.055、0.518±0.067、0.554±0.048)明显升高(P<0.05)。

2.2补肾益气方药对老年大鼠egr1蛋白表达的影响 与青年对照组(0.516±0.024)比较，老年对照组大鼠海马组织egr1蛋白表达(0.290±0.017)明显降低(P<0.05)；与老年对照组相比，老年补肾组、老年益气组、老年合剂组(0.359±0.010、0.343±0.029、0.334±0.123)明显升高(P<0.05)，老年拮抗组(0.303±0.016)有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2补肾益气方药对老年大鼠egr1基因启动子CpG岛甲基化水平的影响 老年对照组大鼠海马组织egr1基因启动子CpG岛一段DNA平均甲基化率比青年对照组高，老年补肾组、老年益气组、老年合剂组比老年对照组低，老年拮抗组比老年对照组高，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

从左至右：青年对照组、老年对照组、老年补肾组、老年益气组、老年合剂组和老年拮抗组图1 各组大鼠egr1 蛋白表达变化

组别位点1位点2位点3位点4位点5平均(x±s)青年对照组04.645.363.3502.67±2.54老年对照组2.164.355.473.523.343.77±1.23老年补肾组04.065.163.4302.53±2.39老年益气组1.915.055.243.231.713.43±1.67老年合剂组03.665.192.9602.36±2.30老年拮抗组2.286.265.373.262.213.88±1.85

3 讨 论

健康大鼠在其记忆形成和突触重塑的认知过程中需要即刻早期生长反应蛋白(IEGs)，抑制这些基因的表达后认知正常动物的记忆也会受损，记忆相关疾病和正常衰老过程中伴随IEG的异常表达〔11〕。DNA甲基化是调控中枢神经系统基因表达的机制，而衰老与大脑中特殊基因的甲基化修饰有关，其中包括egr1〔8〕。本研究中就单个CG位点甲基化率的检测结果表明：第1、5位点在不同实验组中的甲基化率变化明显，老年组的第3、4位点甲基化率最高，转录因子数据库JASPAR预测显示，位点1位于转录因子Pax-5的DNA结合序列中，位点5位于核转录因子NF-1的DNA结合序列中，位点3、4位于核转录因子Sp1/Sp3的DNA结合序列中，这些核转录因子可促进靶基因的转录。由此表明，CG位点的甲基化状态直接影响转录因子Pax-5、Sp1、Sp3、NF-1与启动子区DNA的结合，进而影响基因egr1转录乃至翻译。

中医认为，老年性学习记忆的减退属于“健忘”范畴，其病位在脑而本于肾。肾藏精生髓，脑为髓之海。肾强髓充则元神精湛而记忆不怠；髓海不足，脑失充养，则神明呆滞而引起学习记忆功能减退甚至障碍。左归丸出自明代《景岳全书·新八方阵》，是明代张仲景根据阴阳互补原理研制的“滋补肾阴”的经典补肾方药，八药合用，共凑滋阴补肾、填精益髓之功效。益气聪明汤出自宋金时期著名医家李杲所著的《东垣试效·方卷五》，“聪明”者，为视听灵敏，聪颖智慧之意，此方可使中气得到补益，从而清阳上升，肝肾受益，耳聪目明，神旺脑健。脾胃为“后天之本，气血生化之源”，脾健气足是健脑的重要条件，肾精的充盈赖于脾胃化生的水谷精微儒养。

脾肾相济精足气盛是神旺脑健的重要物质基础。本实验结果进一步证明了补肾益气方药改善老年大鼠学习记忆功能退化的分子机制可能与抑制DNA基因启动子区域CpG岛甲基化修饰、提高学习记忆相关基因egr1 mRNA和蛋白表达有关。

1Haberman RP，Colantuoni C，Stocker AM，etal.Prominent hippocampal CA3 gene expression profile in neurocognitive aging〔J〕.Neurobiol Aging，2011；32(9)：1678-92.

2Jones MW，Errington ML，French PJ，etal.A requirement for the immediate early gene Zif268 in the expression of late LTP and longterm memories〔J〕.Nat Neurosci，2001；4(3)：289-96.

3Renaudineau S，Poucet B，Laroche S，etal.Impaired long-term stability of CA1 place cell representation in mice lacking the transcription factor zif268/egr1〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2009；106(28)：11771-5.

4Rosenzweig ES，Barnes CA.Impact of aging on hippocampal function：plasticity，network dynamics，and cognition〔J〕.Prog Neurobiol，2003；69(3)：143-79.

5Day JJ，Sweatt JD.Epigenetic mechanisms in cognition〔J〕.Neuron，2011；70(5)：813-29.

6Penner MR，Roth TL，Chawla MK，etal.Age-related changes in Arc transcription and DNA methylation within the hippocampus〔J〕.Neurobiol Aging，2011；32(12)：2198-210.

7Oliveira AM，Hemstedt TJ，Bading H.Rescue of aging-associated decline in Dnmt3a2 expression restores cognitive abilities〔J〕.Nat Neurosci，2012；15(8)：1111-3.

8Morse SJ，Butler AA，Davis RL，etal.Environmental enrichment reverses histone methylation changes in the aged hippocampus and restores age-related memory deficits〔J〕.Biology，2015；4(2)：298-313.

9康湘萍，金国琴.补肾方药对老年大鼠学习记忆退化的影响〔J〕.中华中医药杂志，2012；27(4)：981-6.

10Xu L,Holscher C,Anwyl R,etal.Glucocorticoid receptor and protein/RNA synthesis-dependent mechanisms underline the control of synapticplasticity by stress〔J〕.Neurobiology，1998；95：3204-8.

11Chawla MK，Penner MR，Olson KM，etal.Spatial behavior and seizure-induced changes in c-fos mRNA expression in young and old rats〔J〕.Neurobiol Aging，2013，34(4)：1184-98.

〔2017-02-09修回〕

(编辑 袁左鸣)

R28

A

1005-9202(2017)19-4689-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.001

国家自然科学基金面上项目(81473583)

金国琴(1961-)，女，硕士，教授，博士生导师，主要从事中药延缓衰老与预防老年病研究。

尹 芳(1986-)，女，在读博士，主要从事中药延缓衰老的研究。