精神分裂症伴发2型糖尿病与烟碱型乙酰胆碱受体基因多态性关联研究☆

李园园 王周烨 禹顺英 李华芳 沈一峰○☆

精神分裂症伴发2型糖尿病与烟碱型乙酰胆碱受体基因多态性关联研究☆

李园园*王周烨△禹顺英※李华芳※※沈一峰※※○☆

目的在中国汉族精神分裂症患者中探讨烟碱型乙酰胆碱受体基因多态性与2型糖尿病共病的关联。方法采用TaqMan荧光探针基因分型技术对346例伴发2型糖尿病的中国汉族精神分裂症患者和360例不伴糖尿病的精神分裂症患者的α3、α4、α7、α5烟碱型乙酰胆碱受体（neuronal nicotinic acetylcholine receptor，nAchR） 基因即 CHRNA3（rs1317286）、CHRNA4（rs1044396）、CHRNA7（rs6494212） 及 CHRNA5（rs16969968、rs684513）多态位点进行基因分型，比较等位基因频率和基因型频率，并进一步进行基因-基因交互作用分析。结果单位点分析显示男性患者rs6494212位点的等位基因分布和基因型分布在两组间差异均有统计学意义（P＜0.05）；rs1317286、rs1044396、rs16969968、rs684513位点的基因型分布和等位基因分布均无明显差异（P均＞0.05）。CHRNA5基因的两个单核苷酸多态位点（single nucleotide polymorphisms，SNPs）组成的单体型与两组疾病共病关联无统计学意义（P＞0.05）。进一步基因交互作用分析显示rs131726、rs1044396、rs6494212及rs684513这4个位点的联合作用模式可能与两组疾病共病相关（P=0.002）。结论CHRNA7（rs6494212）可能是中国汉族男性精神分裂症患者患2型糖尿病的易感基因。rs1317286、rs1044396、rs6494212及rs684513位点的联合作用可能与精神分裂症共病2型糖尿病相关。

精神分裂症 2型糖尿病 乙酰胆碱受体 基因多态性 关联分析

精神分裂症人群中糖尿病患病率明显升高[1-3]。与一般人群相比，精神分裂症患者生活方式不健康、身体素质较差、抗精神病药物使用导致体重增加等都有可能增大糖尿病患病风险[4]。但是具有类似生活方式或使用抗精神病药物的精神分裂症患者中只有部分合并糖尿病，并且在抗精神病药物广泛应用之前人们已发现精神分裂症患者中糖尿病或其他糖代谢异常的比例较其他人群要高，据此推测遗传因素在二者的共病中可能发挥重要作用[5-6]。胆碱能系统异常是精神分裂症可能的发病机制之一，乙酰胆碱受体基因可能是精神分裂症候选基因[7-9]。有研究显示乙酰胆碱受体基因多态性与糖尿病或胰岛素抵抗相关[10]。本研究选取在两组疾病中都有阳性发现的基因位点[10-13]，即CHRNA3 （rs1317286）、CHRNA4 （rs1044396）、CHRNA7 （rs6494212） 及 CHRNA5（rs16969968、rs684513），对这5个SNPs进行检测，探讨在中国汉族精神分裂症患者中基因多态性与2型糖尿病共病的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2005年1月至2008年12月就诊于上海交通大学医学院附属精神卫生中心门诊及住院治疗的患者。入组标准：①符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnosticand Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）精神分裂症的诊断标准；②精神分裂症伴糖尿病组需符合美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA）2003 年版糖尿病的诊断标准，精神分裂症不伴糖尿病组则不符合此项标准；③汉族；④征得患者本人及其监护人对本研究的知情同意。排除标准：①患有DSM-Ⅳ轴Ⅰ其他精神疾病；②患有其他严重躯体疾病（包括严重的糖尿病并发症）。精神分裂症伴糖尿病组：共入组患者346例，其中男221例，女125例，年龄36～86 岁，平均（60±8）岁。 精神分裂症不伴糖尿病组：共入组患者360例，其中男224例，女136例，年龄为 34～84 岁，平均（59±8）岁。两组年龄性别之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA获取采集入组人员静脉血2 mL，2%依 地 酸 （Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，置于4℃冰箱内保存，并于1周内采用基因组DNA试剂盒 （北京天根生物有限公司生产）提取基因组DNA，于-20℃条件下保存备用。

1.2.2 SNP分型 采用TaqMan荧光探针SNP基因分 型 技 术 对 rs1317286、rs1044396、rs6494212、rs16969968及rs684513位点进行分型。引物和探针由美国应用生物系统公司（APPlied Biosystems Inc，ABI）定制 （探针编号依次为：C-9510308-10，C-25765540-10，C-29057044-10，C-26000428-20，C-7051-10），聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction，PCR）反应试剂由美国ABI提供。PCR反应体系为 5 μL， 包括模板 10 ng，2×TaqMan PCR Master Mix 2.5 μL，20×SNPAssay（包括引物和 FAM/VIC 探针）0.25 μL。反应条件为 95℃预变性 10 min；92℃×15 s，60℃×1 min，40个循环。PCR 反应和荧光信号读取均在 ABI7900HT Sequence Detector（384孔板）上完成，以SDS2.0图像分析软件Allelic Discrimination程序进行终点分析，通过检查不同等位基因标志的FAM和VIC荧光强度，判断各待测样本为野生纯合子、突变纯合子或杂合子。

1.3 统计学方法数据分析主要运用SPSS17.0。计量资料（年龄）采用均数±标准差进行统计描述。运用网络在线SNPstats基因分析软件（httP：//bioinfo.iconcologia.net/SNPstats）计算基因型频数分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，并进行连锁不平衡分析及单体型遗传关联分析，连锁不平衡的测量参数为 D’或 r2，变化范围为0～1，表示重组率的发生，数值越高表明连锁不平衡程度也较高。基因型等位基因分布差异（包括按年龄分组后）采用χ2检验和Logisic回归分析，计算相对危险度（Odds Ratio，OR） 及 95%置 信 区 间 （confidenceintervals，CI）。运用多因子降维法（MDR2.0bata8.4版基因分析软件完成数据处理）进行所选5个多态位点的基因-基因交互作用分析。检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验两组各个SNP位点的等位基因和基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡，观察值和期望值之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 两组基因型和等位基因分布比较伴糖尿病组和不伴糖尿病组各SNPs位点基因型频率和等位基因频率比较结果显示：rs1317286（χ2=1.121，P=0.602）、rs1044396（χ2=0.803，P=0.669）、rs16969968（ χ2=1.087，P=0.724）、rs6494212 （ χ2=1.167，P=0.539）和 rs684513（ χ2=0.051，P=0.975）位点的基因型频率两组间差异无统计学意义；rs1317286（χ2=0.638，P=0.425）、rs1044396 （ χ2=0.245，P=0.621）、rs16969968 （ χ2=0.543，P=0.461）、rs6494212 （ χ2=1.063，P=0.302） 和 rs684513 （ χ2=0.005，P=0.942）位点的等位基因频率两组间差异同样无统计学意义（见表 1）。

表1 两组各SNP位点基因型和等位基因的频率

按性别分组后进行统计分析显示：男性患者中rs6494212位点基因型频率比较 （χ2=5.573，P=0.039）和等位基因频率比较（ χ2=5.329，P=0.021），两组间差异均有统计学意义。rs1317286（χ2=2.203,P=0.380,）、rs1044396（ χ2=1.465,P=0.485）、rs16969968（ χ2=2.558,P=0.235）和 rs684513 （ χ2=1.747,P=0.410）位点的基因型频率两组间差异无统计学意义；rs1317286（ χ2=2.215,P=0.137,）、rs1044396（ χ2=0.014,P=0.904）、rs16969968 （ χ2=2.631,P=0.105）和rs684513（ χ2=0.036,P=0.849）位点的等位基因频率两组间差异同样无统计学意义。女性患者中rs1317286 （ χ2=1.741,P=0.416）、rs1044396 （ χ2=0.517,P=0.789）、rs16969968 （ χ2=1.141,P=0.286）、rs6494212 （χ2=3.978,P=0.102） 和rs684513 （χ2=1.138,P=0.565）位点的基因型频率两组间差异无统 计 学 意 义 ；rs1317286 （ χ2=0.372，P=0.542）、rs1044396 （ χ2=0.406，P=0.524）、rs16969968 （ χ2=2.074，P=0.150）、rs6494212 （ χ2=2.545，P=0.111）和rs684513（χ2=0.110，P=0.741）位点的等位基因频率比较结果两组间同样无明显差异（见表1）。

2.3 连锁不平衡分析及单体型遗传关联分析对CHRNA5（rs16969968，rs684513）基因两个 SNPs位点进行连锁不平衡 （linkagedisequilibrium，LD）分析显示 D’=0.6455，r=-0.0584，D’＞0.5 提示 2 个SNPs位点之间存在一定的LD现象。对2个SNPs位点构成的单体型进行分析，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）（见表 3）。

表2 CHRNA5基因两个SNPs位点构成的单体型两组间关联分析

2.4 基因-基因交互作用以snp1-snp5依次代表每 个 基 因 的 SNPs 位 点 （rs1317286，rs1044396，rs16969968，rs6494212，及 rs684513），最佳交互模型 为 snp1 （rs1317286）， snp2 （rs1044396）、 snp4（rs6494212）及 snp5（rs684513）基因的联合作用模式，该模型的检验样本误差为1-0.4914=0.5086，交叉验证一致性的结果为10/10，检验有统计学意义（P=0.002）（见表 4）。

表4 MDR分析多位点交互作用

3 讨论

与一般人群相比精神分裂症患者死亡率明显升高[4]，死亡率增加的因素有很多，而患糖尿病是其中重要的一项，目前糖尿病共病精神分裂症的研究越来越受到重视和关注。有研究显示精神分裂患者更易患2型糖尿病[14,15]。除了精神分裂症患者不注重健康，精神科药物使用，饮食不健康等因素外，遗传因素也是不可忽略的部分。胆碱能系统异常被认为是精神分裂症可能的病理机制之一。目前一些研究结果显示该系统的nAchR基因多态性与精神分裂症、认知功能减退及听觉视觉引起的注意等都可能存在关联[11-13]。本研究所选5个基因多态位点在既往研究中显示与精神分裂症相关。糖尿病发病的一项重要因素是全身炎症反应，主要为血液中c-反应蛋白、白细胞介素、肿瘤坏死因子等的异常[16]。而中枢神经系统调节炎症反应主要通过nAchR作用于网状内皮细胞参与调节脂质和能量代谢并影响食欲和体重[17]。因此nAchR与糖尿病的发病可能有重要联系。而本研究所选的rs1317286、rs16969968和rs684513多态位点在国外研究中已显示与糖尿病或胰岛素抵抗有关[10]。

本研究中，单个多态位点的分析结果显示5个SNPs与精神分裂症患2型糖尿病无关联。男女性别分组后CHRNA7基因的rs6494212位点基因型频率、等位基因频率两组间差异均有统计学意义。男性精神分裂症患者CHRNA7基因的rs6494212多态性与患2型糖尿病可能相关，该基因可能是男性精神分裂症患者患2型糖尿病的易感基因，携带rs6494212C/T者同时患两种疾病的风险可能较低。CHRNA7基因定位在15号染色体长臂 14区（15q14），基因全长超过 75kb，含有 10个外显子，9个内含子[18]。国外的一些脑组织研究及基因组扫描连锁分析等都显示该基因与精神分裂症有关[19-21]。同时有研究显示α7烟碱型乙酰胆碱能受体（CHRNA7基因编码）参与调节胰岛素分泌，在肥胖者体内表达水平明显降低[22]，MARRERO等[17]通过使用7受体激动剂减少促炎性细胞因子TNF-α，降低血糖、甘油三酯，使2型糖尿病小鼠的食物摄入量减少，体重减轻。以上研究提示该基因在精神分裂症患者和糖尿病患者中可能起到重要作用，但本研究所选位点rs6494212是否影响基因表达或是与其它位点共同作用的结果有待进一步的研究证实。

尽管CHRNA3（rs1317286）、CHRNA5（rs16969968、rs684513）多态位点在国外精神分裂症和糖尿病的关联研究中都有阳性发现，本研究结果显示汉族人群中这些位点多态性与两种疾病共病无关联。单个核苷酸多态性的微效性（minor effect）可能不足以表现出统计学意义，另外种族差异、研究设计不同及抽样误差等都可能影响试验结果。精神疾病和糖尿病均为多基因遗传疾病，其发生可能与多个遗传性多态位点的交互作用有关。RITCHIE等[23]提出一种非参数、无需遗传模式的分析方法，即MDR，用来分析疾病易感基因间的交互作用，其本质是组合划分方法的延伸，采用数据将维策略，在有限样本条件下分析高维数据间交互作用，侧重离散型变量，减少I类错误。本研究对5个多态位点进行交互作用分析，结果显示四位点模型（rs1317286× rs1044396× rs6494212× rs684513）为最佳模型，交叉验证一致性为10/10，检验样本误差相对较低为0.5086，单个位点分析结果未显示所选5个多态位点与两种疾病相关，交互作用分析却有阳性发现，这也反映了基因-基因交互作用的重要性。

本 研 究 进 行 CHRNA3（rs1317286）、CHRNA4（rs1044396）、CHRNA7 （rs6494212） 和 CHRNA5（rs16969968、rs684513）基因位点多态性与精神分裂症患者患2型糖尿病的易感关联研究，但入组病例数相对较少，可能会产生偏倚。另外，缺少基因环境交互作用的相关分析，今后可补充相关资料进一步研究。

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The study on the association between neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit genes and type 2 diabetes in Chinese Han schizophrenics.

LI Yuanyuan,WANG Zhouye,YU Shunying,LI Huafang,SHEN Yifeng.Shanghai Mental Health Center,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,NO.600 Wanpingnan road,Shanghai 200030,China.Tel:021-34773657

ObjectiveTo explore the relationships between neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit gene polymorphisms and type 2 diabetes in Chinese han schizophrenics．MethodsFive single nucleotide polymorphisms(SNPs)of CHRNA3(rs1317286),CHRNA4(rs1044396),CHRNA7(rs6494212)and CHRNA5(rs16969968,rs684513)gene were analyzed in a sample of 346 schizophrenics with type 2 diabetes and 360 schizophrenics without type 2 diabetes.The five markers were genotyped by the TaqMan fluorogenic detection method with the ABI7900.ResultsThere were no significant differences in alleles and genotypes distribution of the five genes between two groups(P ＞0.05)．For the CHRNA7(rs6494212),there were significant difference in genotypes(P=0.039)and alleles distribution(P＜0.021)betweentwo groups in male patients．The haplotypes constructed by markers of CHRNA5 were not associated with the 2 diabetes in Chinese Han male schizophrenics.The interaction analysis revealed a significant association between models made up by rs1317286,rs1044396,rs6494212,rs684513and 2 diabetes in Chinese Han male schizophrenics(P=0.002).ConclusionThe CHRNA7(rs6494212)gene may be one of common susceptible genes for 2 diabetes in Chinese Han male schizophrenics．There is a significant association between models made up by rs131726rs1044396,rs6494212,rs684513 and schizophrenics with type 2 diabetes.

Schizophrenia Type 2 diabetes Nicotinic acetylcholine receptor Polymorphism Association study

R749

A

2017-05-06）

（责任编辑：肖雅妮）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.08.004

☆上海交通大学医学院转化医学协同创新中心项目（编号：TM201506，TM201624）

* 复旦大学附属中山医院心理医学科（上海 200032）

△上海交通大学医学院附属新华医院临床心理科

※上海交通大学医学院附属精神卫生中心遗传实验室

※※上海交通大学医学院附属精神卫生中心，上海市重性精神病重点实验室

○☆通信作者（Email：shenyifeng@yahoo.com）