δ阿片受体激动剂在全脑缺血再灌注损伤中的神经保护机制☆

韩洁韵 梁庆 彭翔 黄伟青 梁子敬

·论 著·

δ阿片受体激动剂在全脑缺血再灌注损伤中的神经保护机制☆

韩洁韵*○☆梁庆*彭翔*黄伟青*梁子敬*

目的观察δ阿片受体激动剂DADLE对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡细胞及磷酸化p38表达的影响，探讨DADLE在全脑缺血再灌注损伤细胞凋亡中的脑保护机制。方法采用二血管加低血压阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注模型，随机分为假手术组（n=10），模型组（n=10），治疗组（再按DADLE静脉注射不同剂量分为3个亚组2 mg组、3 mg组、5 mg组，n=10），TUNEL法检测凋亡细胞，Western blot检测神经元磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）蛋白的表达。结果DADLE可显著减少大鼠缺血神经元细胞凋亡，与假手术组比较，缺血后大鼠神经元磷酸化p38 MAPK表达水平增加（P＜0.05），与模型组比较，治疗组各组磷酸化p38 MAPK表达水平有所降低（LSD-t值依次为0.61、1.61、1.8，P＜0.05），且其作用呈剂量依赖性。结论δ阿片受体激动剂DADLE对大鼠全脑缺血再灌注损伤有神经保护作用，抑制磷酸化p38 MAPK的表达，减少细胞凋亡是其脑保护作用机制之一。

受体 阿片样 δ再灌注损伤 细胞凋亡

全脑缺血再灌注是心脏骤停后大脑损伤的重要病理生理过程。细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤病理过程中发挥重要的作用。p38丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）通路是细胞应激反应诱导细胞凋亡的主要信号转导途径，与脑缺血再灌注损伤有密切关系[1]。DADLE（D-Aa2-D-Leu5-enkephalin）是人工合成的delta阿片受体激动剂。已有研究表明，DADLE对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用[2]，但具体机制不完全清楚。本研究通过建立大鼠全脑缺血再灌注模拟心脏骤停后的大脑损伤状态，观察DADLE对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡细胞数的影响，检测p38 MAPK蛋白表达的变化，探讨DADLE能否通过改变p38的表达水平从而减轻脑缺血再灌注损伤中的细胞凋亡，进一步探索DADLE脑保护的可能机制，评估其在心肺脑复苏中的价值。

1 资料与方法

1.1 动物及实验分组成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠 50 只，体质量 350～400 g，随机分为5组：①假手术组（Sham组，n=10），行手术分离血管，不结扎血管及再灌注；②缺血-再灌注组（I/R 组，n=10），缺血 15 min，再灌注 120 min；③DADLE 2 mg·kg-1组（DADLE 2 组，n=10），缺血后 15 min后再灌注开始前给予 DADLE（2 mg·kg-1,iv），然后进行再灌注120 min；④DADLE 3 mg·kg-1组（DADLE 3组，n=10），缺血后15 min后再灌注开始前给予 DADLE（ 3 mg·kg-1,iv），然后进行再灌注 120 min； ⑤DADLE 5 mg·kg-1组，（DADLE 5组，n=10），缺血后15 min后再灌注开始前给予DADLE（5 mg·kg-1,iv），然后进行再灌注 120 min。

1.2 动物模型制作使用二血管阻断加低血压法制作大鼠全脑缺血再灌注模型[3]。10%水合氯醛（350 mg·kg-1体质量）腹腔注射麻醉，分离暴露双侧股动脉，行股动脉插管，右侧股动脉置管接BL-420生物机能记录系统监测动脉血压。左侧股动脉保留置管作为放血和回输血途径。颈正中切口，分离双侧颈总动脉及左侧颈静脉，经左侧颈静脉插管,建立给药途径，静注肝素150 IU·kg-1。经左股动脉回抽血液。当平均动脉压达35~40 mmHg时，用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉。此为缺血期开始。期间经左侧股动脉回抽放血或注射回输血液保持平均动脉压在35~40 mmHg。15 min缺血期后移去微型动脉夹去除双侧颈总动脉的夹闭，回输血液，使平均动脉压恢复至实验前的水平，此为再灌注期，本次实验再灌注期时间为120 min。

1.3 TUNEL法检测凋亡细胞实验结束后处死大鼠，断头放血后开颅取脑经冰生理盐水漂洗，将脑组织沿冠状面对半切开后取含额叶前半脑置于4%多聚甲醛固定，脱水后常规石蜡包埋。石蜡切片常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化后，严格按照TUNEL试剂盒（Roche,11684817910）说明书操作，光镜下凋亡细胞核固缩呈棕褐色，为圆形，新月形或不规则形。每组内每张切片随机挑选2个200倍视野进行拍照。拍照时让组织充满整个视野。应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片阳性细胞的比率（阳性细胞数/总细胞数）即为细胞凋亡指数。

1.4 Westernblot检测大鼠断头后迅速取出脑组织，加入细胞裂解液研磨，匀浆离心后，去上清液用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白含量。取40 μg样本凝胶电泳及转膜后，蛋白即转至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加一抗：磷酸化的p38 MAPK、β-actin兔抗鼠多克隆抗体，4℃过夜，随后TBST洗膜3次，加二抗过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育30 min，ECL显色。将胶片进行扫描存档，Image J软件处理系统分析目标带的光密度值。以β-actin为内参照。将相对光密度值作为统计学分析数据。

1.5 统计学方法采用SPSS13.0进行统计学分析，结果以（±s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，DADLE处理各组与模型组的比较采用LSD-t检验，DADLE处理各组两两组间均数之间的比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 TUNEL染色光镜下，正常脑组织细胞核显蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一棕黄色（TUNEL阳性），细胞膜皱缩，凋亡细胞核固缩呈棕褐色，边集、碎裂，为圆形，新月形或不规则形（见图1）。与假手术组相比，缺血再灌注后各组的凋亡指数明显上升（P＜0.05）。在DADLE处理组中，无论是3 mg·kg-1组还是5 mg·kg-1组凋亡指数均较缺血再灌注组下降（LSD-t分别为 13.47、20.73，P＜0.05），2 mg·kg-1组的凋亡指数亦较缺血再灌注组下降，但无统计学意义（LSD-t=4.51，P=0.118＞0.05）。 凋亡指数在DADLE不同剂量处理组之间两两比较有统计学差异（q 值依次为 53.95、26.16、37.73，P＜0.05）。

图1 各组大鼠海马细胞凋亡情况（400×） ①Sham组②I/R组③DADLE2组④DADLE3组⑤DADLE5组 #：与Sham组比较，P＜0.05，*：与 I/R 组比较 P＜0.05

2.2 p38 MAPK表达Westernblot检测结果 各组均可见特异性条带表达。假手术组检测到少量pp38 MAPK蛋白的表达，与假手术组比较 （0.27±0.03），I/R 组 （0.46±0.04）p-p38 MAPK 的表达水平明显增高 （P＜0.05），DADLE处理各组 p-p38 MAPK的表达水平较I/R组降低（LSD-t值依次为0.61、1.61、1.8，P＜0.05）。 不同剂量处理组之间两两比较有统计学差异 （q值依次为 4.6、4.0、3.0、2.8，P＜0.05）（见图 2）。

图2 W est ernbl ot检测p38蛋白表达的结果 #：与Sham组比较，P＜0.05，*：与 I/R 组比较 P＜0.05

3 讨论

心脏骤停可造成大脑再灌注损伤，其中涉及兴奋性氨基酸的神经毒性，钙离子稳态失调，神经元凋亡等机制[4-5]。

DADLE是美国SIGMA公司人工合成的一种δ阿片受体激动剂，可以同时激动δ1和δ2受体。既往研究发现δ阿片受体系统与缺血再灌注有着密切的关系。激动δ阿片受体可减轻缺血再灌注损伤。MARZIONI等[6]的实验证明，δ阿片受体参与了减轻细胞凋亡的保护机制。ZHENG等[7]的实验则证实，DADLE在缺血再灌注中的神经保护机制可能是通过下游的MEK-ERK通路起作用。因此DADLE对于全脑缺血再灌注的神经保护效应机制还需要更多的实验研究来阐明。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）级联反应是细胞内重要的信号传导系统之一,p38MAPK信号传导通路是MAPK通路的分支之一,它通过转录因子磷酸化而改变基因的表达水平,参与多种胞内信息传递过程,能对广泛的细胞外刺激发生反应,介导细胞生长、发育、分化及死亡全过程。细胞信号转导通路在脑缺血性损伤过程中起着重要的基因调控作用。近几年的研究结果表明，p38丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路可能直接参与脑缺血损伤中多种病理生理过程包括细胞凋亡的的调控[8]。ASARE等[9]发现，环境污染物3-硝基荧蒽 （3-nitrofluoranthene,3-NF）可诱导MAPK家族成员ERK1/2、JNK和p38磷酸化激活，进而导致细胞凋亡。

本研究采用在体实验的方法，建立大鼠全脑缺血再灌注模型模拟心跳骤停而造成全脑缺血及心肺复苏后的全脑缺血再灌注状态，观察不同剂量DADLE对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡细胞及磷酸化p38表达的影响，发现DADLE呈剂量依赖的减少缺血再灌注中的神经元凋亡，缺血后大鼠神经元磷酸化p38 MAPK表达水平增加，与I/R组比较，DADLE治疗组磷酸化p38 MAPK表达水平有所降低，且其作用呈剂量依赖性。由此推断，降低磷酸化p38 MAPK的表达，抑制细胞凋亡可能是DADLE对全脑缺血再灌注大鼠的神经保护机制之一。DADLE是一种有前景的脑保护剂，深入研究其神经保护机制为临床开发新型的脑保护药物提供分子及细胞水平的依据，从而为提高心肺复苏后的脑复苏成功率。

[1]IRVING EA,BAMFORD M.Role of mitogen and stress activated kinases in ischemic injury[J].Cereb Blood Flow Metab,2002,22（6）：631-647

[2]DUAN YL,WANG SY,ZENG QW,et al.Astroglial reaction to delta opioid peptide [D-Ala2,D-Leu5]enkephalin confers neuroprotection against global ischemia in the adult rat hippocampus[J].Neuroscience,2011,192（1）：81-90.

[3]HIDENORI ENDO,HIROSHI KAMADA,CHIKAKO NITO，et al.Mitochondrial Translocation of p53 Mediates Release of Cytochrome c and Hippocampal CA1 Neuronal Death after Transient Global Cerebral Ischemia in Rats[J].Neurosci,2006,26（30）：7974-7983.

[4]欧阳馥冰,陈艺聪,曾进胜.PSD-95抑制剂在缺血性脑损伤后的神经保护作用[J].中国神经精神疾病杂志,2015,41(6)：380-382

[5]RITTENBERGER JC,POLDERMAN KH,SMITH WS,et al.E-mergency neurological life support：resuscitation following cardiac arrest[J].Neurocrit Care,2012,17（S 1）：S21-38.

[6]MARZIONI M，INERNIZZI P，CANDELARESI C，et a1．Human cholangiocarcinoma development is associated with dysregulation of opioidergic modulation of cholangiocyte growth[J]．Dig Liver Dis，2009，41（7）：523—533．

[7]ZHENG YJ1,WANG XR,CHEN HZ,et al.Protective effects of the delta opioid peptide[D-Ala2,D-Leu5]enkephalin in an ex vivo model of ischemia/reperfusion in brain slices[J].CNS Neurosci Ther,2012,18（9）：762-766

[8]李国辉，王耀辉.p38丝裂原活化蛋白激酶途径对大鼠脑缺血再灌注后脑组织基质金属蛋白酶-9表达及脑水肿形成的影响[J].临床神经病学杂志,2015,28（3）：214-217

[9]ASARE N,LAGADIC-GOSSMANN D,HOLME JA.3-nitrofluoranthene （3-NF）-induced apoptosis and programmed necrosis[J].Autophagy,2009,5（5）：751-752

The neuroprotective machanism of Delta-opioid receptor activator against global cerebral ischemia-reperfusion.

HAN Jieyun,LIANG Qing,PENG Xiang,HUANG Weiqing,LIANG Zijing.Department of Emergency,the Firset Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,No.151,Yanjiang Road,Guangzhou 510123,China.Tel：020-83062120.

ObjectiveTo investigate the effects of Delta-opioid receptor activator DADLE on the expression of the p38 MAPK and the neuronal apoptosis after global cerebral ischemia-reperfusion and explore the neuroprotective mechanisms of DADLE.MethodsGlobal cerebral ischmemia-reperfusion models in rats were induced by bilateral common carotid artery occlusion combined with hypotension.Rats were randomly divided into sham group(n=10),ischemia-reperfusion group(n=10)and three treatment groups with different doses of DADLE（2 mg group,3 mg group,5 mg group,n=10）.TUNEL method and Western blot analysis were used to measure apoptotic neurons and expression levels of p38 MAPK phosphorylation,repectively.ResultsDADLE treatment significantly reduced neuron apoptosis(P＜0.05).The expression levels of p38 MAPK were increased in ischemia-reperfusion group than in sham group (P＜0.05).In DADLE treated groups,the expression levels of p38 MAPK were dose-dependently decreased compared with the ischemia-reperfusion group.ConclusionDelta-opioid receptor activator DADLE can be neuroprotective against global I/R injury.Attenuation of apoptosis and p38 MAPK signal pathway might be involved in the neuroprotective mechanism of DADLE.

Receptor Opioid Delta Reperfusion injury Apotosis

R74

A

2017-03-21）

（责任编辑：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.08.001

☆广州市医药卫生科技项目（编号：20141A011078）

* 广州医科大学附属第一医院急诊科（广州510120）○☆

（E-mail：dr_hjy@163.com）