XRCC1在胶质瘤中的表达及意义

刘 岩 付旭东

郑州大学第五附属医院神经外科，河南 郑州 450052

·论著临床诊治·

XRCC1在胶质瘤中的表达及意义

刘 岩 付旭东△

郑州大学第五附属医院神经外科，河南 郑州 450052

目的分析XRCC1在脑胶质瘤，癌旁组织和正常组织中的表达情况。方法郑州大学第五附属医院神经外科2015-07—2016-03经手术切除的脑胶质瘤标本50例，按病理类型可分级，另取因高血压所导致的脑出血行正常脑组织切除减压患者标本10例为对照组。依次检测不同级别的脑胶质瘤和正常脑组织中XRCC1的表达情况，比较XRCC1在不同级别的脑胶质瘤和正常脑组织中以及在不同年龄及性别中的阳性率和相关性。结果低度恶性组胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级)XRCC1阳性率低于高度恶性组胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)，差异无统计学意义(P>0.05)；在10例正常脑组织标本中XRCC1表达总阳性率为0%。XRCC1在正常脑组织与胶质瘤组织表达有显著差异(P<0.05)；50例胶质瘤患者组织标本中XRCC1的表达与患者年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。结论XRCC1在神经胶质瘤中的表达明显高于正常脑组织；XRCC1阳性率的表达与神经胶质瘤的恶性级别无相关性。

脑胶质瘤；XRCC1；免疫组化；表达意义

脑胶质瘤来源于神经胶质细胞，总体发病率占颅内原发肿瘤发病率的50%[1]，是中枢神经系统最常见的原发肿瘤。脑胶质瘤呈浸润性生长，与周围正常组织分界不清，位于大脑功能区的胶质瘤，即便采用显微神经外科技术也很难完全切除，术后易复发，对放疗不甚敏感，传统化疗药物不易通过血脑屏障，效果不理想，而且有毒副作用。胶质母细胞瘤患者的平均生存期12～15个月[2]，近期的研究结果表明，XRCC1的基因多态性与头颈部、肺部、结肠、前列腺等多种恶性肿瘤的发病风险有关。本研究运用免疫组化的方法对50例不同级别的脑胶质瘤患者和10例正常脑组织中XRCC1的表达进行测定，并分析其与胶质瘤恶性程度的关系。

1 资料与方法

1．1病例选择收集郑州大学第五附属医院神经外科2015-07—2016-03经手术切除的脑胶质瘤标本50例，所有标本均通过我院病理科诊断证实，按病理类型可分为：星形胶质瘤21例，多形性胶质母细胞瘤14例，室管膜瘤7例，髓母细胞瘤8例。按照2007年WHO中枢神经系统肿瘤分级(Ⅰ～Ⅳ级)，可将50例标本分为：Ⅰ级胶质瘤10例，Ⅱ级胶质瘤13例，Ⅲ级胶质瘤15例，Ⅳ级胶质瘤12例。其中将Ⅰ～Ⅱ级归为低度恶性组(23例)，Ⅲ～Ⅳ级归为高度恶性组(27例)，50例患者年龄16～70岁，平均43岁，男23例，女27例，另取由高血压所导致的脑出血行正常脑组织切除减压患者标本10例为对照组。对照组标本均通过我院伦理协会批准。

1．2入选标准(1)50例患者均为首次入院，行手术治疗前均未进行过任何放、化疗或免疫治疗；(2)患者入院后均行常规检查，且结果回示排除患有其他部位肿瘤；(3)肿瘤直径2～8 cm，所有肿瘤均为显微镜下手术全部切除或者大部分切除；(4)手术方案是经过我院神经外科全体医师讨论并由资深医师主刀，术中所得病理组织，均经我院病理科检验确诊为胶质瘤；(5)确保石蜡组织的质量良好；(6)所选患者依从性良好，术后随访态度积极；(7)随访资料及患者临床资料保存完整。

1．3主要实验试剂浓缩型兔抗人XRCC1单克隆抗体(购自福州迈新公司)、柠檬酸盐抗原修复液、苏木素染液、DAB显色剂(购自北京中山金桥生物公司)、伊红染液、APES防脱片剂、二甲苯、无水乙醇。

2 实验方法

2．1石蜡切片的制备过程首先在术中取材后固定，用纯化水充分冲洗后脱水，再将组织进行透明和浸蜡，浸蜡完成之后再放入蜡槽中包埋，用石蜡切片机将蜡块切成4～5 μm厚的切片，将切片放入35 ℃的温水中展片，展平之后放在涂有很薄层蛋白甘油的载玻片摆正，最后放入格盘中用温箱烘干粘片，以上步骤完成之后即可进行染色。

2．2 HE染色的步骤(1)切片首先经过烤箱烤片1 h，后进行脱蜡。(2)先用苏木素染色15 min后，用纯化水冲洗。(3)再用盐酸酒精分色3 min，用纯化水冲洗。(4)置玻片于40～50 ℃的温水中反蓝2 min。(5)伊红复染3～5 min。(6)先用梯度酒精脱水各15 min，然后用二甲苯透明两次，再用中性树胶封片，制备HE染色切片进行常规病例切片观察，与免疫组化结果对照观察。

2．3免疫组化检测的步骤(1)实验进行前先将切片在烤箱中烤2 h。(2)开始脱蜡和水化。(3)每张切片上滴加1滴3%的过氧化氢溶液，在室温下孵育20 min。(4)0.01 PBS冲洗5 min×3次。(5)采用高温高压组织抗原修复。(6)3%过氧化氢浸泡，蒸馏水冲洗。(7)0.01 PBS冲洗，正常羊血清室温下孵育。(8)滴加抗兔抗人XRCC1，置4 ℃冰箱12 h。(9)0.01 PBS冲洗，滴加试剂1，室温孵育。(10)0.01 PBS冲洗，滴加试剂2，室温孵育。(11)0.01 PBS冲洗，滴加DAB显色液。(12)中止染色，先用苏木素轻度复染，后盐酸酒精分化，在温水中反蓝。(13)梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。

2．4免疫组化阳性结果判断XRCC1阳性结果的判定采用半定量积分法，以切片标本细胞核和(或)胞浆出现棕黄色颗粒者为准，具体标准为：(1)阳性细胞数小于5%者0分，6%～25%者1分，26%～50%者2分，51%～75%者3分，76%以上者(包括76%)4分。(2)阳性细胞强度：浅黄色者1分，黄色者2分，棕褐色者3分。按照(1)(2)两标准得分的乘积值来定阳性分级，0分者阴性(-)，1～4者弱阳性(+)，5～8分者阳性(++)，9～12分者强阳性(+++)。检测结果均要求在双盲条件下由主要研究人员和经验丰富的病理科人员两位阅片评估。使用购买试剂时赠送的阳性切片作对照。

2．5统计学方法所有数据均通过SPSS 17.0软件完成:2组均值比较采用t检验；临床病理资料等计数资料分析采用卡方检验或 Fisher 精确概率法，检验水准α=0.05。

3 结果

3．1 XRCC1在不同级别神经胶质瘤中的表达50例神经胶质瘤和10例正常脑组织切片染色成功。XRCC1的阳性表达表现为免疫组织化学染色在细胞的细胞核和胞浆内出现棕黄色颗粒，大部分阳性细胞分布不规则。XRCC1在胶质瘤阳性表达率为38%，在正常脑组织的阳性表达为0%，由此可见神经胶质瘤患者的XRCC1阳性表达率明显高于正常人。见表1、2。

表1 XRCC1在神经胶质瘤与正常脑组织的表达 (n)

表2 XRCC1在不同级别神经胶质瘤中的表达 (n)

3．2 XRCC1在不同性别胶质瘤患者中的阳性率和相关性50例神经胶质瘤患者，男23例，女27例，其中23例男性患者中，XRCC1表达为阳性者7例，阳性率30.43%；27例女性患者中，XRCC1表达为阳性者13例，阳性率48.15%。XRCC1在不同性别胶质瘤患者中的表达阳性率比较无显著统计学差异。见表3。

3．3 XRCC1在不同年龄段胶质瘤患者中的阳性率和相关性50例患者年龄16～70岁，平均43岁，其中≥40岁患者XRCC1表达为阳性者11例，阳性率34.38%，<40岁患者XRCC1表达为阳性者8例，阳性率44.44%。见表4。

表4 XRCC1在不同年龄段胶质瘤患者中的表达阳性率和相关性

4 讨论

中枢神经胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤之一，占成年人颅内原发性恶性肿瘤相当大比例，恶性神经胶质瘤程弥漫浸润性生长，侵袭性强，生长速度快，与附近正常脑组织分界不清，手术难以彻底切除，故复发率高，具有显著的占位效应，患者在较短时间内就可出现高颅压症状。传统治疗方法效果差，患者生存期短，多数患者最后死于肿瘤细胞的耐药性，神经胶质瘤的治疗已成为神经外科学上一重大难题。目前对于胶质瘤患者的治疗手段主要是手术联合放化疗的综合治疗，但胶质瘤可生长于颅内多个区域，常累及脑内重要功能区，侵犯脑内重要血管，且部分病人侵犯部位深、体积大，所以手术很难完全切除，且术后复发极快，患者生存期短，预后相当差。

现阶段临床上使用比较多的化疗药物主要是铂类药物和烷化剂类药物，这两类药物的作用靶点均为胶质瘤细胞的DNA，胶质瘤细胞的DNA修复能力很大程度上决定胶质瘤对化疗药物的耐药性，XRCC1是胶质瘤细胞DNA修复基因的一种类型，它在肿瘤细胞的表达强度直接影响了肿瘤细胞对铂类药物的耐药性。本次研究的主要目的就是通过检测XRCC1在神经胶质瘤细胞内的表达情况，研究其对抗肿瘤药物的耐药机制从而为在临床上更好的治疗胶质瘤患者提供参考。人类XRCC1是影响细胞对电离辐射敏感性分离出的第一个哺乳动物基因，染色体19q13.2-13.3区属于XRCC1的编码基因，编码基因全长约31.9 Kb，cDNA长约2.2 Kb，由17个外显子组成[3]，编码产物为一个由633个氨基酸构成的蛋白质。XRCC1本身不具有酶的催化活性，而是作为连接蛋白参与碱基修复切除和单链DNA断裂修复。通过细胞融合与X射线的互补实验，现已鉴定出11个遗传族群，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP )是最常见的人类可遗传的一种变异，可导致氨基酸的编码发生改变，包括单碱基的转换、颠换、插入、缺失等改变，Shen[4]等报道了XRCC1的3处常见突变，分别使氨基酸发生了Arg转变成Trp，Arg转变成His，Arg转变成Gln的替换效应，由DNA修复基因SNP所引起的不同个体DNA修复能力不同，使机体对疾病的易感性发生变化，这也是肿瘤易感因素之一。XRCC1是现阶段研究最多的一种DNA修复基因，广泛参与电离辐射和氧化反应所导致单链DNA断裂和碱基损伤修复，其表达异常跟多种恶性肿瘤的发生有关，XRCC1编码的蛋白本身不具有酶催化活性，而是作为连接蛋白参与碱基修复切除和单链DNA断裂修复。DNA修复基因的多态性影响着DNA的修复能力，目前已发现XRCC1蛋白质共有3个功能域，分别与不同的酶发生作用，参与基因修复的不同步骤和类型。XRCC1的突变使基因的稳定性下降，可能会增加肿瘤的易感性。先前的研究结果表明：XRCC1的多态性与临床上多见的大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生风险有关[5-6]。近期的研究表明XRCC1的多态性与神经胶质瘤的发生有关[7]。

铂类药物进入胶质瘤细胞后直接与DNA结合，形成DNA加合物，通过限制DNA的解旋来抑制DNA的复制，肿瘤细胞的繁殖速度比正常组织细胞的繁殖速度快，且肿瘤细胞对受损DNA的修复功能并不完善，DNA的修复能力是影响铂类抗肿瘤药物疗效的关键[8]。XRCC1是一种重要的DNA修复基因，它所编码的蛋白质参与碱基修复切除和单链DNA断裂修复，对维持基因组的稳定性具有十分重要的作用。不同个体的XRCC1的表达情况有所不同[9]，这也可能是不同个体之间DNA修复能力不同的原因之一。DNA的修复能力跟机体对肿瘤的易感性和抗肿瘤药物的疗效有着很大联系：DNA的修复能力越强，机体对肿瘤的易感性越低，但对抗肿瘤药物的耐药作用可能会增强，反之亦然。

本研究通过免疫组化发现XRCC1在胶质瘤组织中的表达，可能对胶质瘤耐药的研究提供新的思路，然而XRCC1通过何种途径参与肿瘤的进展及浸润，能否通过抑制XRCC1的表达来抑制胶质瘤的生长及耐药性，将是我们下一步的任务所在。

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(收稿2017-03-20)

责任编辑：王喜梅

TheexpressionandsignificanceofXRCC1ingliomastissues

LiuYan，FuXudong

DepartmentofNeurosurgery，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

ObjectiveTo analyze the expression of XRCC1 in glioma and adjacent tissues and normal tissues．Methods50 samples of brain gliomas removed from surgery in department of neurosurgery of The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University from July 2015 to March 2016 were collected．All samples had been diagnosed，verified and graded according to pathological types by the pathology department of our hospital．Besides，10 samples of normal brain tissues resected from patients with cerebral hemorrhage caused by hypertension were collected as control group．The XRCC1 expression in the two groups was detected and the positive rate and correlation between XRCC1 in brain gliomas of different levels and the relation of XRCC1 with age and gender were analyzed．ResultThe difference between the XRCC1 positive rate of low-degree malignant group of glioma (Ⅰ-Ⅱ) and that of high-degree malignant group of glioma (Ⅲ-Ⅳ) had no statistical significance (P>0.05)．Among 10 samples of normal brain tissues，the total positive expression rate of XRCC1 was 0%．According to statistical analysis，there was significant difference between the expression of XRCC1 in normal brain tissues and glioma tissues (P<0.05)．Among the 50 samples of glioma tissues，after statistical analysis，there was no difference between the expression of XRCC1 in the patients' ages and genders (P>0.05)．ConclusionThe expression of XRCC1 in gliomas is significantly higher than that in normal brain tissues；the expression of XRCC1's positive rate has no correlation with the malignant degrees of gliomas．

Brain gliomas；XRCC1；Immunohistochemistry；Expressive meaning

R730.264

A

1673-5110(2017)18-0046-04

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.18.014

△通信作者：付旭东(1976—)，博士，副主任医师。研究方向：神经外科。Email：fxd@126.com