复合羟固醇无机小牛骨块修复犬下颌骨临界骨缺损的组织学研究*

胡晓，刘威，吴王喜，桂媛媛，周磊

[南方医科大学口腔医院（广东省口腔医院），广东 广州 510280]

复合羟固醇无机小牛骨块修复犬下颌骨临界骨缺损的组织学研究*

胡晓，刘威，吴王喜，桂媛媛，周磊

[南方医科大学口腔医院（广东省口腔医院），广东 广州 510280]

目的比较复合羟固醇无机小牛骨块（羟固醇骨块）和无机小牛骨粉在比格犬下颌骨临界骨缺损动物模型早期愈合阶段的成骨效应。方法选取健康雄性比格犬4只，拔除双侧下颌第3和第4前磨牙以及第1磨牙（P3-M1）后，双侧下颌骨各复制2个5 mm×10 mm×10 mm标准化箱型临界骨缺损。4周愈合期后，按半口对照设计，随机将羟固醇骨块和无机小牛骨粉植入骨缺损。术后4周处死，切取标本制作石蜡和硬组织切片，行组织学观察及组织形态学测量。结果实验动物愈合良好，羟固醇骨块组及无机小牛骨粉组均见临界骨缺损边缘及骨材料-宿主骨交界处明显的成骨细胞及新骨形成。HE染色组织形态学测量结果显示羟固醇骨块组和无机小牛骨粉组新生骨面积比分别为（37.22±2.16）%和（34.70±2.66）%，两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）；羟固醇骨块组成骨细胞数[（31.13±2.85）]与无机小牛骨粉组[（24.88±2.95）]比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。硬组织切片亚甲基蓝-酸性品红染色组织形态学测量结果显示羟固醇骨块及无机小牛骨粉骨材料新生骨面积相对百分比分别为（20.13±1.32）%和（19.28±0.82）%，骨材料相对存留率分别为（30.80±1.16）%和（29.69±1.12）%，两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论羟固醇骨块在犬下颌骨临界骨缺损早期骨愈合阶段具有类似于小牛骨粉的成骨效果。由于羟固醇骨块具有良好的空间维持能力，更适合于临床大面积骨缺损的修复。

小牛骨；骨诱导性；成骨细胞；骨缺损

Abstract:ObjectiveTo compare osteogenic effect of oxysterols coated bovine bone blocks(OBB)and bovine bone particles(BBP)in critical-sized dog mandible defects at the early stage of bone healing.MethodsFour Beagle dogs were selected.Following extraction of the third and fourth mandibular premolars as well as the first molar(P3-M1),two standardized box-shaped defects(5×10×10 mm)were created at the alveolar ridge in each quadrant(4 defects per animal,a total of 16).After 4 weeks of healing period,the defects were reshaped and randomly allocated in a split-mouth design to either OBB(8 defects)or BBP(8 defects)group.All animals were euthanized after 4 weeks.The specimens were dehydrated for hematoxylin and eosin staining and non-decalcified sectioning.ResultsThe postoperative healing was good.OBB exhibited abundant osteoblasts and new bone formation in the defect area. Histomorphometrical analysis(HE staining)revealed that the percentage of new bone was(37.22±2.16)%in theOBB group and(34.70±2.66)%in the BBP group,there was no significant difference between the two groups(P＞0.05);and the number of osteoblasts was(31.13±2.85)in the OBB group which was significantly larger than(24.88±2.95)in the BBP group(P＜0.05).Histomorphometrical analysis(methylene blue-acidic fuchsin staining)revealed that the rate of new bone formation was(20.13±1.32)%in the OBB group and(19.28±0.82)%in the BBP group, the degradation rate was(30.80±1.16)%in the OBB group and(29.69±1.12)%in the BBP group,the differences were not statistically significant(P＞0.05).ConclusionsOBB have similar osteogenic effect as BBP at the early stage of bone healing.Because OBB have good space maintaining property,they are more suitable for the repair of large bone defects.

Keywords:bovine bone;osteoinductivity;osteoblast;bone defect

创伤、肿瘤、疾病等导致的严重骨缺损给口腔种植及骨外科临床修复重建带来巨大挑战。骨移植已经成为临床治疗骨缺损最常用的手段，自体骨移植被认为是骨移植与修复治疗的金标准[1]。然而由于自体骨移植来源有限，附加手术损伤，增加患者不适感，其临床应用受限。因此，人工骨移植替代材料的使用已经成为临床骨缺损修复重建最常用的一种方法。无机小牛骨粉因其具有天然多孔结构及与人骨相似的理化结构，良好的骨引导性能和生物相容性，获得了较好的临床效果[2]。但是，颗粒状骨移植材料稳定性和空间维持能力欠佳，不适用于较大范围的骨缺损，而块状骨移植材料即使使用在大面积缺损中也具有极强的易塑性和空间维持能力。但无机小牛骨块至今仍未能在临床上广泛应用，有研究发现[3]骨缺损修复过程中，块状骨移植材料较颗粒状骨移植材料表现出较差的骨引导性和骨诱导性，因此成骨效果不甚理想。鉴于此，提高骨块移植的成骨效应，有利于提高其在临床大面积骨缺损修复治疗中的应用。已有大量的体外和动物实验报道了羟固醇在诱导成骨细胞分化和成骨方面的促进作用，但目前尚无无机小牛骨块作为支架材料负载羟固醇后在体内成骨效应观察的相关报道。本实验以无机小牛骨块为支架材料，通过物理吸附的方法复合羟固醇，期望其具有较好的骨修复能力。本文旨在比较复合羟固醇无机小牛骨块（羟固醇骨块）及无机小牛骨粉在比格犬的下颌骨临界骨缺损动物模型早期骨愈合阶段的成骨效应，为羟固醇骨块的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取成年雄性比格犬4只，犬龄（16.8±2.4）岁，体重12～15 kg，由广东省实验动物监测所提供。健康良好，适应性饲养1周后开始实验，实验期间喂食软食。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.2 实验材料

无机小牛骨块、无机小牛骨粉（烟台正海生物技术有限公司），羟固醇（美国Sigma-Aldrich公司）。

1.3 羟固醇与无机小牛骨块的体外复合

将无机小牛骨块浸入配制成的羟固醇/乙醇溶液（1 mg/ml）中，非共价物理吸附羟固醇，静置1/2 h后低温无菌保存。

1.4 实验方法

1.4.1 第1阶段 速眠新肌内注射（肌注）镇静（0.2 ml/kg），3%戊巴比妥那溶液（0.3 ml/kg）静脉注射全身麻醉成功后，常规术区备皮、消毒、铺巾。分根微创拔除双侧下颌第3和第4前磨牙以及第1磨牙（P3～M1），沿牙槽嵴顶纵向切开黏骨膜，翻瓣，0.9%无菌生理盐水冷却下，使用裂钻、小球钻定位并切透双侧下颌骨的颊侧骨皮质，使用骨凿劈开骨皮质块，完整保留舌侧骨板，碳化硅磨头塑形。下颌两边分别制备出2个标准化箱型临界骨缺损（4个/只，n=16），大小5 mm×10 mm×10 mm（颊舌向距离为5 mm，牙合龈向距离10 mm，近远中向距离为10 mm），缺损间隔5 mm；黏骨膜瓣复位，丝线间断缝合。

1.4.2 第2阶段 术后愈合4周，全身麻醉下重新沿牙槽嵴顶纵向切开黏骨膜，翻瓣，去除获得的慢性骨缺损内的肉芽组织并重新塑形，按照半口对照设计，随机一侧植入羟固醇骨块（n=8），另一侧植入无机小牛骨粉（n=8），制作减张切口，黏骨膜瓣复位，丝线间断缝合。术后每天软食喂养，术后7 d肌注青霉素（80×106u/d），口腔局部碘甘油上药，观察比格犬生活状态、术区创口愈合情况。处死前13和14 d皮下注射10 mg/ml盐酸四环素荧光剂（30 mg/kg），处死前3和4 d注射10 mg/ml钙黄绿素荧光剂（10 mg/kg）。

1.5 检测指标

2次手术后4周处死实验动物，进行如下指标观察。

1.5.1 大体标本观察 观察骨材料移植区牙槽嵴的外形，及有无骨移植材料暴露、脱落、黏膜红肿、感染等表现。

1.5.2 HE染色组织学检测及组织形态学分析 切取完整植入术区和周围2 mm骨组织，10%甲醛固定。将固定好的标本颊舌向正中切割为两半，一半制作硬组织切片，另一半制作脱钙切片。14%EDTA脱钙后，苏木精-伊红染色（HE），光镜观察。每个标本取3张脱钙切片，每张切片在高倍镜（×200）随机选取3个视野用Image Pro Plus 6.0专业图像分析系统作骨形态计量学分析。①新生骨面积比（新生骨面积/计量总面积×100%）；对每张切片的3个视野进行图像采集并计量新生骨面积，累计总和计算新生骨面积，每个标本取3张切片的平均值。②为了检测羟固醇在成骨过程中可能的作用，对成骨细胞计数。对每张切片的3个视野进行图像采集并计量成骨细胞数，取3个视野平均值，每个标本取3张切片的平均值。

1.5.3 硬组织切片荧光观察 激光共聚焦显微镜低倍镜（×20）对硬组织切片进行荧光检测，观察两组新生骨的分布情况。

1.5.4 硬组织切片亚甲基蓝-酸性品红染色组织学检测及组织形态学分析 每个标本取2张亚甲基蓝-酸性品红染色硬组织切片，每张切片在高倍镜（×100）观察并随机选取3个视野用Image Pro Plus 6.0专业图像分析系统作骨形态计量学分析，每张切片取3个视野平均值，每个标本取2张切片的平均值。①新生骨面积相对百分比（新生骨面积/测量区域面积×100%）；②骨材料相对存留率（未降解骨代用品存留面积/测量区域面积×100%）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.2统计软件对组织形态学测量数据进行分析，结果均以均数±标准差（±s）表示，对组织形态学测量数据进行正态分布和方差齐性检验，若正态分布和方差齐则采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体情况

实验动物愈合良好，各组均见牙槽骨丰满，黏膜完整，未见红肿、暴露、感染等表现。

2.2 组织形态学测量结果

2.2.1 组织学观察结果 4周时，临界骨缺损边缘及骨材料-宿主骨交界处见明显新骨形成，骨材料起到支架作用，可见新骨由缺损边缘向骨材料内部生长表现，大量新生不成熟的骨组织和纤维组织覆盖骨缺损。高倍镜下见新生骨组织主要是不规则的编织骨，在新生骨小梁周围可见成排的成骨细胞围绕。同时，可以见到不成熟的新生血管。在羟固醇骨块组新生骨小梁和成骨细胞表现的更为密集。见图1。

2.2.2 新生骨面积比 羟固醇骨块及无机小牛骨粉新生骨面积比分别为（37.22±2.16）%和（34.70±2.66）%，统计数据符合正态分布，Levene's test检查：F=0.076，方差齐；经两独立样本t检验，两者比较差异无统计学意义（t=2.057，P=0.057）。

2.2.3 成骨细胞数 羟固醇骨块及无机小牛骨粉成骨细胞数分别为（31.13±2.85）和（24.88±2.95）个，统计数据符合正态分布，Levene's test检查：F= 0.096，方差齐；经两独立样本t检验，差异有统计学意义（t=4.310，P=0.001），羟固醇骨块成骨细胞数高于无机小牛骨粉。

2.3 硬组织切片荧光观察结果

原宿主旧骨无明显标记，新生骨组织螯合盐酸四环素呈现黄色，螯合钙黄绿色呈现亮绿色，羟固醇骨块和无机小牛骨粉组在4周时均可见荧光呈网状分布在骨材料周边尤其是近宿主骨-骨材料交界面处，而在骨材料内部也可见少量不均匀的荧光分布。荧光结果提示：临界骨缺损中心新生骨少于骨缺损-骨材料交界处。见图2。

2.4 硬组织切片亚甲基蓝-酸性品红染色组织形态学测量结果

2.4.1 组织学观察结果 羟固醇骨块和无机小牛骨粉组在骨缺损内部仍可见大量未被降解的淡红染色骨材料，在骨缺损边缘及骨材料表面可见被染为深红色的新生骨组织，而缺损中心部位深红色染色区域较少，深红染色新生骨组织外围可见细胞核深蓝染色的成骨细胞。骨材料孔隙周围还可见纤维组织充填。见图3。

2.4.2 新生骨面积相对百分比 羟固醇骨块及无机小牛骨粉新生骨面积相对百分比分别为（20.13±1.32）%和（19.28±0.82）%，统计数据符合正态分布，Levene's test检查：F=3.089，方差齐；经两独立样本t检验，两者差异无统计学意义（t=1.533，P=0.148）。

2.4.3 骨材料相对存留率 羟固醇骨块及无机小牛骨粉骨材料相对存留率分别为（30.80±1.16）%和（29.69±1.12）%，统计数据符合正态分布，Levene'stest检查：F=0.211，方差齐；经两独立样本t检验，差异无统计学意义（t=1.965，P=0.07）。

图1 组织学观察结果 （HE染色×200）

图2 硬组织切片荧光观察结果 （×20）

图3 硬组织切片亚甲基蓝-酸性品红染色观察结果（×100）

3 讨论

近年来，已有大量文献报道了羟固醇在兔颅顶骨的临界骨缺损中具有促进新骨生成的作用。临界骨缺损是指无法自行愈合的关键尺寸骨缺损，更适用于较大范围骨缺损的块状人工骨的移植研究[4]。本实验采用比格犬的临界骨缺损模型，因其具有与人类相似的结构特征和愈合能力，且骨量充分，能准确制备标准的骨缺损模型[5]。同时采用无机小牛骨粉作为对照，能更好地为羟固醇骨块的临床使用提供理论依据。

大量针对无机小牛骨材料负载生长因子或小分子药物利用其骨诱导性从而促进其成骨效果方面的研究取得了较好的效果。SCHWARZ等[6]在比格犬动物模型中比较颗粒状和块状无机小牛骨负载rhGDF-5和rhBMP-2的成骨效果。研究结果显示复合rhBMP-2的骨移植材料较复合rhGDF-5的骨移植材料表现出增多的新骨生成。BMP-2是一种存在于骨基质中的小分子多肽，能诱导成骨细胞分化和骨细胞成熟[7]，但是其来源有限，价格昂贵，半衰期短，易代谢流失，为了获得较好的成骨效果常需大剂量使用[8]，有引起不良反应的可能。而羟固醇是一种小分子药物，作为胆固醇内源性细胞生物合成途径的中间产物，具有高度稳定性和骨诱导性[9]，理论上具有诱导骨细胞分化以提高块状骨移植材料成骨效应的可能。

体外研究证实羟固醇可能通过非标准Wnt通路和刺猬通路促进成骨细胞增殖和分化[10]，激活的Wnt通路还可能参与维持成体组织的动态平衡[11]。本实验组织形态学测量结果显示，羟固醇骨块较无机小牛骨粉表现出明显增多的成骨细胞数，提示了羟固醇在骨愈合早期对成骨细胞的增殖可能具有促进作用。本实验结果说明羟固醇骨块具有与无机小牛骨粉相似的促进早期骨缺损修复的能力。MARIE等[12]指出成骨细胞的招募在成骨过程中具有关键作用，新骨的形成主要取决于成骨细胞的数量而非成骨细胞的活性。从以上实验结果分析，羟固醇有可能通过促进成骨细胞的增殖、分化，从而有助于块状骨的成骨过程，但具体的作用机制还需进一步研究分析。AGHALOO[13]也报道了相似的实验结果，骨髓间充质干细胞与羟固醇接触的时间越长，诱导成骨分化的能力越强，鼠颅骨缺损动物实验也证实羟固醇实验组的成骨较空白对照组快而明显。

硬组织切片的荧光检测结果表明，两组的新生骨主要分布于骨缺损边缘和骨材料-宿主骨交界处，骨缺损中心成骨明显减少。已有较多研究发现边缘和中心成骨不均匀分布的现象易发生在临界骨缺损的骨愈合过程中[14-15]。可能是由于临界骨缺损中心部位常缺乏营养和氧气，因而影响血管和骨组织的新生，进而出现缺损中心和外周成骨不均匀的现象[4，16-17]。由于不理想的局部微环境，即使已有文献证实羟固醇具有良好的骨诱导性，也难以在骨缺损中心区域发挥其作用。除此之外，羟固醇从骨移植材料快速释放也可能是骨缺损中心成骨较少的原因之一。药物或生长因子长时有效的缓慢释放意味着延长药物作用时间[18]。研究发现骨缺损的愈合常起源于骨缺损边缘然后随时间延长逐渐向中心生长[19]。而羟固醇局部快速释放后，难以长期维持有效浓度，发挥稳定的骨诱导作用，因此在临界骨缺损中的成骨作用较为局限。HOKUGO[20]研究证实生物材料中缓释的羟固醇可以提高其在兔颅骨缺损中的成骨效果。

多种因素影响均会影响骨移植材料的降解，包括骨移植材料的成分、物质结构、孔隙率大小、植入区的局部环境以及动物类别等，虽然本实验进行的是骨愈合早期初步的观察研究，不能全面评估羟固醇骨块的吸收及降解过程，但是本实验结果提示羟固醇骨块和无机小牛骨粉均有一定程度的降解，且负载羟固醇并未影响小牛骨块的降解。

块状骨移植物在临床中的使用具有颗粒状材料无法比拟的优势，可以维持形态并且更加稳定，而颗粒状材料容易受压变形，并不适合在大范围的缺损及咬合受力区应用[21]。因此，提高块状骨移植物在大面积骨缺损中的成骨效果具有重要的临床意义。本实验研究了羟固醇骨块在比格犬的临界骨缺损早期愈合阶段的成骨效应，观察到明显增多的成骨细胞数量，这一结果可能与羟固醇能促进动物体内早期骨缺损愈合过程中成骨细胞的功能活动有关，同时本实验结果表明在羟固醇骨块在临界骨缺损的修复治疗时，具有与无机小牛骨粉相似的成骨效应，鉴于其具有良好的形态和空间维持能力，更适合于大面积骨缺损及咬合受力区的修复，因此具有广阔的应用前景。由于本实验是首次将羟固醇骨块应用于比格犬的临界骨缺损修复，难以参考相关文献确定合适的复合羟固醇的剂量范围，本实验虽然证实了体外复合羟固醇/乙醇溶液剂量的有效性，但无法确定其即为最理想的浓度值，提高复合的羟固醇剂量是否可能提高其成骨效应以及有关的成骨机制、中晚期的成骨效应及羟固醇的缓释是否能发挥更好的促成骨作用，需进行进一步的研究证实。

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（张西倩 编辑）

Oxysterols coated bovine bone blocks used in critical-sized defects of mandible:a histomorphometric study in dogs*

Xiao Hu,Wei Liu,Wang-xi Wu,Yuan-yuan Gui,Lei Zhou
[Stomatological Hospital of Southern Medical University(Guangdong Provincial Stomatological Hospital),Guangzhou,Guangdong 510280,China]

R-332

A

2016-11-23

国家自然科学基金（No：81170998）；广东省医学科研基金（No：C2012034）

周磊，E-mail：zho668@263.net；Tel：020-84233801

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.001

1005-8982（2017）22-0001-06