化学杀菌剂对乳杆菌烈性噬菌体P1的灭活效果

范梦茹，刘颖，吴文茹，汪政煜，张和平，陈霞

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018)

化学杀菌剂对乳杆菌烈性噬菌体P1的灭活效果

范梦茹，刘颖，吴文茹，汪政煜，张和平，陈霞

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018)

使用不同浓度的化学杀菌剂（乙醇、异丙醇、次氯酸钠、过氧乙酸）对噬菌体P1进行灭活并在3 min内完成其灭活效果的评估。结果显示，除过氧乙酸外，其他3种化学杀菌剂对P1的灭活效果均随着浓度的上升而逐渐加强。100%的异丙醇可使P1存活率瞬间下降到0.3%（减少3.79个对数级）。当次氯酸钠含量达到8×10-4时，P1可完全失活。

化学杀菌剂；乳杆菌；烈性噬菌体；灭活

0 引 言

目前，乳酸菌已被广泛用于工业发酵，然而发酵菌株都曾发现过宿主噬菌体[1]。植物乳杆菌发酵食品可以提高产品的感官特性[2,3]，而噬菌体的污染，会导致产品质量下降[4]。虽然采取了一定的措施，但噬菌体仍然是导致乳品工业发酵失败的主要原因之一。

工业上常采用合理设计工厂、改善卫生等来减少噬菌体污染[4]。热处理与高压处理也用于灭活噬菌体，但部分噬菌体在高温高压条件下仍可存活[5-7]。此外，化学杀菌剂消毒原料及设备的同时使噬菌体失活，也可有效减少噬菌体数量。

乳杆菌烈性噬菌体P1分离自植物乳杆菌IMAU10120异常发酵液[8]。本文研究了食品工业用化学杀菌剂对该噬菌体的灭活效果，以期为工业生产中噬菌体的灭活提供一定的数据支持和理论依据。

1 实验

1.1 菌株、噬菌体及其培养条件

植物乳杆菌IMAU 10120在MRS中37℃下常规培养过夜，作为噬菌体P1的宿主菌株。将宿主菌株接入MRS-Ca培养基中培养至OD600≈0.5后，接入噬菌体P1，对其进行扩增，并将噬菌体放在4℃保存。实验采用双层平板法计数，单位为PFU/mL。

1.2 乙醇对烈性噬菌体P1的灭活效果

参照2009年Briggiler所描述的方法[9]配制体积分数分别为0%，5%，15%，25%，30%，50%，75%，100%的乙醇；分装900 μL于1.5mL EP管中，然后将100 μL噬菌体裂解液（约108PFU/mL）分别于上述浓度的乙醇中混合均匀，梯度稀释后采用双层平板法对不同浓度乙醇处理下的噬菌体计数（整个过程控制在3 min内完成），37℃培养16～18 h，观察噬菌斑，计算其灭活效果。

1.3 异丙醇对烈性噬菌体P1的灭活效果

配制体积分数为0%，5%，15%，25%，30%，50%，100%的异丙醇；分装900 μL于1.5 mL EP管中，其他步骤同1.2所述。

1.4 次氯酸钠对烈性噬菌体P1的灭活效果

配制含量分别为0，50，100，150，200，400，600，8×10-4的次氯酸钠，分装900 μL于1.5 mL EP管中，其他步骤同1.2所述。

1.5 过氧乙酸对烈性噬菌体P1的灭活效果

配制体积分数0%，0.15%，0.3%，0.45%，0.6%，0.75%，0.9%的过氧乙酸；分装900 μL于1.5 mL EP管中，其他步骤同1.2所述。

1.6 数据统计与分析

所有实验均进行3次，使用SPSS软件处理数据，采用单向方差分析，P＜0.05，用Excal软件作图。

2 结 果

2.1 乙醇对烈性噬菌体P1的灭活效果

噬菌体P1接入不同体积分数（0%，5%，15%，25%，30%，50%，75%，100%）的乙醇中，其灭活效果如图1所示。由图1可以看出，体积分数为5%的乙醇对P1的灭活效果较差，仅可使5%的噬菌体灭活（对数级基本没变）；之后，随着乙醇体积分数的逐渐增大，对噬菌体的灭活效果逐渐上升；当乙醇体积分数为100%时，P1的存活率虽为1.9%，但仅下降了1.73个对数级，不能使其完全失活。

图1 乙醇对烈性噬菌体P1的灭活效果

2.2 异丙醇对烈性噬菌体P1的灭活效果

噬菌体P1接入不同体积分数（0%，5%，15%，25%，30%，50%，100%）的异丙醇中，其灭活效果如图2所示。由图2可以看出，5%的异丙醇对P1基本没有影响；当异丙醇体积分数上升到50%时，P1的存活率下降到5%（下降1.30个对数级）；当达到100%时，对P1的灭活效果显著增加，此时存活率为0.3%（下降3.79个对数级）。

图2 异丙醇对烈性噬菌体P1的灭活效果

2.3 次氯酸钠对烈性噬菌体P1的灭活效果

不同含量次氯酸钠（0，5×10-5，1×10-4，1.5×10-4，2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4）对P1的灭活效果如图3所示。与乙醇和异丙醇相比，5×10-5的次氯酸钠就可使94.7%的P1失活，对数级下降为6.46 PFU/mL；但是随着含量的增加，次氯酸钠对P1的灭活效果却没有显著增长。当次氯酸钠含量增加到4×10-4时，此时可使P1下降2.50个对数级。浓度为6×10-4时，可使P1下降2.94个对数级，这时P1的存活率下降到0.12%。当含量达到8×10-4时，可使P1完全失活。

图3 次氯酸钠对烈性噬菌体P1的灭活效果

2.4 过氧乙酸对烈性噬菌体P1灭活效果

不同体积分数的过氧乙酸（0%，0.15%，0.3%，0.45%，0.6%，0.75%，0.9%）对P1的灭活效果如图4所示。由图4可以看出，不同体积分数的过氧乙酸对P1的活力并没有明显影响（平均对数值为7.71 PFU/mL），当体积分数增长到0.9%时，P1存活率仍在85%以上（对数值7.68 PFU/mL）。

图4 过氧乙酸对烈性噬菌体P1的灭活效果

3 讨论

关于化学杀菌剂（乙醇、异丙醇、次氯酸钠、过氧乙酸）对乳酸菌噬菌体的灭活效果，许多学者都进行过相关研究，结果发现，化学杀菌剂对噬菌体的灭活效果不尽相同。

1996年，Maillard研究了乙醇对铜绿假单胞菌噬菌体F116的灭活能力，结果显示噬菌体比细菌对醇类更具有抗性。由于乙醇主要是通过改变细菌原生质膜的脂质成份使微生物失活，对于噬菌体，乙醇虽然改变了噬菌体的衣壳蛋白结构，但对DNA却没有损伤[10]。2000年，Binetti检测了乙醇对不同嗜热链球菌噬菌体的灭活效果，结果显示75%的乙醇灭活效果最好，但是不同的噬菌体对其敏感度不同，灭活噬菌体021-4需要15 min，灭活噬菌体031-D和噬菌体CYM需要30 min，噬菌体021-5和噬菌体0BJ则需要更长的灭活时间（大于45 min）[11]。2003年，Quiberoni利用体积分数100%乙醇对德氏乳杆菌噬菌体BYM、YAB、LL-H和Ib3进行了处理，结果显示，噬菌体YAB需作用15 min，LL-H需作用30 min，其他需要45 min以上才能完全失活[12]。2010年，Ebrecht也对该种类噬菌体进行过研究，文中表明，噬菌体Cb1/204达到完全失活至少需要100%的乙醇作用45 min[13]。关于干酪乳杆菌噬菌体，Capra在2004年和2006年均做过相关研究，结果显示，体积分数100%的乙醇灭活噬菌体PL-1、J-1和MLC-A均需要45 min以上。2012年，Mercanti对噬菌体iLp84和iLp1308进行检测，得到了与Capra同样的结果[6,14-15]。2009年，Briggil⁃er用100%的乙醇灭活植物乳杆菌噬菌体B1、B2、FAGK1和FAGK2，45 min后4种噬菌体仍无法完全失活[9]。乙醇可用于空气与地面表面卫生的清洁，与其他杀菌剂结合后可以有更好的杀菌效果[10]。本研究通过不同浓度乙醇对乳酸菌烈性噬菌体P1进行灭活实验后发现，随着乙醇体积分数的增加，P1的存活率逐渐下降；当乙醇体积分数达到100%时，P1的存活率下降到1.9%，没有完全失活。可能是由于乙醇体积分数过高，在噬菌体表面反而形成了一层保护膜，导致衣壳蛋白在短时间内无法全部分解。

异丙醇与乙醇的灭活原理一致，关于其对噬菌体的灭活效果，以下学者也做过相应的研究。2000年，Binetti检测了100%异丙醇对嗜热链球菌噬菌体的灭活效果，结果显示处理灭活噬菌体031-D需要15 min[11]。1999年，Quiberoni利用100%异丙醇处理瑞士乳杆菌噬菌体CNRZ 832-B1和CNRZ 0241，5 min后可使其完全失活[16]。2002年Suárez的研究表明，乳酸乳球菌噬菌体001仅需3.8 min处理即可被100%的异丙醇完全失活[17]。综上所述，使用100%的异丙醇对噬菌体进行灭活时，至少需要处理3.8 min，而大多数的噬菌体则需要超过45 min。本实验中，100%的异丙醇可使噬菌体P1的存活率瞬间下降到0.3%，基本达到完全灭活。

1998年，Maillard指出次氯酸钠是通过改变噬菌体的衣壳结构，聚集噬菌体的尾部蛋白来使其失活的，然而不同噬菌体对次氯酸钠的耐受力却呈现出一定的差异性[10]。2002年，Suárez用次氯酸钠对噬菌体进行灭活实验，结果显示，3×10-4的次氯酸钠可在2.7 min使噬菌体046完全失活；2×10-4ppm的次氯酸钠则需3.1 min使噬菌体QP4失活，同时可在瞬间使噬菌体001和QF12失活[17]。对于德氏乳杆菌噬菌体，Ebrecht与Quiberoni都进行过相关研究。2010年，Ebrecht发现噬菌体Cb1/204和Cb1/342对次氯酸钠显示出不同的耐受性。虽然完全灭活时间均为2.5 min，但灭活噬菌体Cb1/204所需浓度为2×10-4，而噬菌体Cb1/342却为3×10-4[13]。2003年，Quiberoni发现，4×10-4次氯酸钠需要5～45 min才能使德氏乳杆菌噬菌体BYM、YAB和LL-H完全失活；对于噬菌体Ib3，虽利用1.2×10-3处理45 min以上，但仍不能使其完全失活[12]。2009年，Briggiler用8×10-4的次氯酸钠灭活植物乳杆菌噬菌体 ATCC 8014-B1、ATCC 8014-B2、FAGK1和FAGK2，结果显示，除噬菌体ATCC 8014-B2外（需15 min），其他3种均需要灭活30 min[9]。2012年，Mercanti研究发现，8×10-4的次氯酸钠对不同副干酪乳杆菌噬菌体的作用效果不同，灭活噬菌体iLp84需要30 min，iLp1308仅需5 min[6]。工业生产中，常用浓度为5×10-5的次氯酸钠作为洗手液，消毒器具的浓度为1×10-4，消毒鞋靴为2×10-4～3×10-4。本实验中，8×10-4的次氯酸钠可以使P1失活，但是该浓度高于工业使用范围[9]。

过氧乙酸不仅会使噬菌体的衣壳蛋白结构改变，而且会使噬菌体的核酸完全断裂[10,14]。过氧乙酸可以有效灭活大部分的微生物，却不受其他物质的影响（如过氧化氢酶），并且其作用的温度和pH值范围较为广泛[10]。关于过氧乙酸灭活噬菌体，所有的研究结果均显示，过氧乙酸是灭活噬菌体的最佳化学试剂[6,9,11-17]，灭活2～5 min就能使噬菌体完全失活。但是在本实验中，不同含量的过氧乙酸对噬菌体P1却没有明显的灭活效果。

4 结论

实验结果显示，除过氧乙酸外，随着化学杀菌剂浓度的升高，其对P1的灭活效果增强。体积分数100%乙醇虽然可灭活98.1%的噬菌体，但并不能使其完全失活。与乙醇相比，体积分数100%的异丙醇对P1的灭活效果有所提高，可以使噬菌体P1的存活率下降到0.3%（下降了3.79个对数级），但仍无法达到完全失活效果。8×10-4的次氯酸钠虽可使P1失活，但该浓度高于工业经常使用的浓度，因此不适合在工业生产中使用。综上所述，完全依赖单一的化学杀菌剂无法在短时间内使P1完全失活，因此，可以适当延长化学杀菌剂作用于P1的时间，或者可以结合其他的灭活方法，以达到完全灭活P1的目的。

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Inactivation effect of chemical biocides on lactobacillus virulent phage P1

FAN Mengru,LIU Ying,WU Wenru,WANG Zhengyu,ZHANG Heping,CHEN Xia

（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural Universi⁃ty,Hohhot 010018,China）

Different concentrations of various chemical biocides were used for the inactivation of lactobacillus virulent phage P1,and the inac⁃tivate effect evaulation was finished in 3 min.Besides peracetic acid,the inactivate effects of the other three biocides were increased with the increasing of biocide concentration.The survival rate of phage P1 in 100%isopropanol was reduced to 0.3%(with 3.79 log decreased)in 3 min.When the concentration of sodium hypochlorite reached 8×10-4,phage P1 can be completely inactivated.

chemical biocide;lactobacillus;virulent phage;inactivation

Q939.48

A

1001-2230（2017）08-0008-03

2016-12-06

国家自然科学基金青年科学基金项目（31301517），内蒙古自治区自然科学基金面上项目（2013MS1207），内蒙古自治区研究生科研创新资助项目（S20161012904）。

范梦茹（1994-），女，硕士研究生，研究方向为乳品生物技术。

陈霞