HPLC波长切换联合梯度洗脱法同时测定冰梅上清丸中儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3

严 莺

HPLC波长切换联合梯度洗脱法同时测定冰梅上清丸中儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3

严 莺

目的建立HPLC波长切换联合梯度洗脱法同时测定冰梅上清丸中的儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3。方法采用Kromasil C18色谱柱；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液，进行梯度洗脱；流速：0.9 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长分别规定为280 nm (儿茶素、表儿茶素)和210 nm (去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3)。结果儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3分别在18.16～363.20 μg/mL (r=0.999 9)、14.89～297.80 μg/mL (r=0.999 7)、5.35～107.00 μg/mL (r=0.999 6)、4.92～98.40 μg/mL (r=0.999 4)、4.15～83.00 μg/mL (r=0.999 9)范围内与峰面积线性关系良好，平均加样回收率分别为98.74%、97.57%、99.37%、97.74%、98.13%，RSD分别为1.21%、0.96%、0.80%、1.10%、1.68%。结论本文建立的方法可作为冰梅上清丸的质量控制方法。

HPLC；波长切换法；梯度洗脱法；冰梅上清丸；儿茶素；表儿茶素；去芹糖桔梗皂苷E；桔梗皂苷E；桔梗皂苷D3

0 引言

冰梅上清丸是由儿茶、桔梗等十一味中药材加工制成的水丸制剂，具有清热退火的功效，临床上主要用于上焦积热、喉肿疼痛、鼻干口苦、口舌生疮等疾病的治疗。本品服用方便，疗效确切。冰梅上清丸收载于卫生部颁药品标准(中药成方制剂第7册)，现标准仅规定了性状及丸剂的检查项[1],未对该制剂处方中的任何药物所含成分进行定量测定，现文献报道中也未检索到对该制剂进行定量测定的文献报道，儿茶和桔梗为冰梅上清丸中的主要药物，为确保冰梅上清丸质量稳定和疗效一致性，本文以方中儿茶所含儿茶素、表儿茶素和桔梗[2]中所含去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3为指标成分[2]，采用HPLC波长切换联合梯度洗脱法同时进行测定，为冰梅上清丸质量标准的提高提供有效依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-M20A检测器、自动进样器、柱温箱CTO-10ACvp)(岛津公司)；BS423S 型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，KQ-250B超声波发生器(昆山市超声波仪器有限公司)。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；桔梗皂苷E对照品(237068-41-6)来源于成都德思特生物技术有限公司；儿茶素对照品(110877-201604)、表儿茶素对照品(110878-200102)来源于中国食品药品检定研究院；桔梗皂苷D3对照品(67884-03-1)来源于湖北巨胜科技有限公司；去芹糖桔梗皂苷E对照品(849758-42-5)来源于武汉天植生物技术有限公司；冰梅上清丸(每30粒重1 g；批号：151105、160307、160412)来源于成都九芝堂金鼎药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Kromasil C18色谱柱；流速：0.9 mL/min；进样量：10 μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脱(0～8 min，10.0%A；8～14 min，10.0%A→16.0%A；14～23 min，16.0%A→32.0%A；23～30 min，32.0%A→10.0%A)[3-5]；0～14 min时在280 nm[6-7]波长下检测儿茶素和表儿茶素，14～30 min在210 nm[8]波长下检测去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3。此系统条件下所测组分与其他组分分离效果良好，理论塔板数按儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3计均不低于3 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 取对照品儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3各适量，精密称定，加60%甲醇溶解并稀释，分别制成质量浓度分别为1.816、1.489、0.535、0.492、0.415 mg/mL的对照品储备液。再分别依次吸取配制好的以上对照品储备液各5.0、5.0、1.0、2.5、1.0 mL，置50 mL量瓶中，用60%甲醇稀释至刻度，即得冰梅上清丸混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取冰梅上清丸适量，研成细粉，取约3.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加60%甲醇50 mL，称定重量，KQ-250B超声波发生器超声处理30 min，放冷至室温，用60%甲醇补足减失重量，充分振摇均匀，过滤，取续滤液，即得冰梅上清丸供试品溶液。

2.3 阴性对照专属性实验 按照冰梅上清丸质量标准项下载明的处方比例，制备缺儿茶和桔梗的水丸，再按照“2.3”项的方法制备阴性样品溶液。取阴性样品溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各 10 μL，在“2.1”项色谱条件下依法进行测定。结果在与儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3对照品色谱图相应的保留时间处，供试品溶液色谱图中有儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3吸收峰，而阴性样品溶液色谱图中未显示对应的吸收峰，说明阴性无干扰，色谱图见图1。

图1 对照品(A)、样品(B)、阴性(C)色谱图

注：1.儿茶素，2.表儿茶素，3.去芹糖桔梗皂苷E，4.桔梗皂苷E，5.桔梗皂苷D3

2.4 线性关系考察 取6个10 mL量瓶，依次精密吸取上述制备的儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3单一成分对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别用60%甲醇稀释并定容，摇匀，制得6个系列浓度的混合对照品溶液，分别进样10 μL进行测定，以峰面积Y作为纵坐标，对照品质量浓度X作为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，见表1。

2.5 重复性试验 取批号为151105的冰梅上清丸，按“2.3”项的制备方法制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下的方法进样检测，分别计算儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3的含量，并计算各组分含量的RSD，结果各组分含量的RSD分别为1.16%、1.09%、0.76%、1.25%、1.57%。

2.6 稳定性试验 取同一批号的同一供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、12 h后，分别进样儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3。结果表明，冰梅上清丸供试品溶液在室温下12 h内稳定，儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3的峰面积的RSD分别为0.78%、0.85%、1.21%、1.04%和1.03%。

2.7 仪器精密度试验 取“2.2”项下的混合对照品溶液，按“2.1”项下规定的色谱条件和测定方法重复进样6次，记录儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3的峰面积，计算其RSD值，结果所测各组分峰面积的RSD分别为1.02%、0.83%、1.23%、0.74%、1.01%。

2.8 加样回收率试验 分别称取儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3对照品各适量，用60%甲醇制成浓度为0.879、0.637、0.292、0.571、0.235 mg/mL的对照品溶液，备用。取冰梅上清丸(批号：151105)6份，每份约1.5 g，研成细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入上述备用对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备加样回收样品溶液。按照“2.1” 项下色谱条件进样检测，计算5个组分的回收率及RSD，结果见表2。

表1 线性关系实验结果

表2 儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3回收率

2.9 样品测定 取3个批号的冰梅上清丸，按文中规定的供试品制备方法，在本文规定的色谱条件下，进样测定，每次进样量为 10 μL，依法测定冰梅上清丸中儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3含量，结果见表3。

表3 含量测定结果(n=3，mg/g)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的确定 为了能同时满足儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3对提取溶剂的要求，笔者分别选取超声提取和水浴回流2种方式，以所测成分儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3的提取率为考察指标，优选最佳的提取方式，实验结果表明，在相同提取时间条件下，超声提取和水浴回流提取所测各成分的提取率差异不大，因超声提取较为简便稳定，故选取超声提取作为冰梅上清丸供试品溶液的提取方式；同时，笔者对提取溶剂进行了对比考察(乙醇、30%甲醇、60%甲醇、甲醇)，结果以60%甲醇为提取溶剂时，所测各成分的综合提取率最高。在此基础上，笔者分别对不同提取时间(20、30、40 min)进行考察，结果超声提取30 min和超声提取40 min所测各成分提取率差异不大，但明显优于超声提取20 min。故冰梅上清丸供试品溶液最佳提取方法为60%甲醇超声提取30 min。

3.2 儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3含量限度的确定 根据儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3含量的平均值的80%，建议暂定本品每1 g含儿茶以儿茶素计，不得少于2.8 mg，以表儿茶素计不得低于1.7 mg；含桔梗以去芹糖桔梗皂苷E计不得低于0.15 mg，以桔梗皂苷E计不得低于0.30 mg，以桔梗皂苷D3计不得低于0.12 mg。

4 结论

高效液相波长切换联合梯度洗脱法同时测定冰梅上清丸中儿茶素、表儿茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3的方法，操作简便，可以作为冰梅上清丸的质量控制标准，为确保用药安全提供有力保障。

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Simultaneousdeterminationofcatechin,epicatechin,deapioplatycodinE,platycodinEandplatycodinD3inBingmeiShangqingpillbyHPLCwavelengthswitchingcombinedwithgradientelutionmethod

YAN Ying

(Tongren Hospital Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200336,China)

ObjectiveTo develop a method of HPLC wavelength switching combined with gradient elution method for the simultaneous determination of the content of catechin,epicatechin,deapio platycodin E,platycodin E and platycodin D3in Bingmei Shangqing pill.MethodsA Kromasil C18column was used as the chromatographic column,the mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution for gradient elution;the flow rate was 0.9 mL/min,and the column temperature was set at 30 ℃.Catechin and epicatechin were detected at 280 nm,while deapio platycodin E,platycodin E and platycodin D3were detected at 210 nm.ResultsCatechin,epicatechin,deapio platycodin E,platycodin E and platycodin D3had a good linear relationship with peak area respectively within 18.16～363.20 μg/mL (r=0.999 9),14.89～297.80 μg/mL (r=0.999 7),5.35～107.00 μg/mL (r=0.999 6),4.92～98.40 μg/mL (r=0.999 4) and 4.15～83.00 μg/mL (r=0.999 9).The average recoveries (RSD) were 98.74% (1.21%),97.57% (0.96%),99.37% (0.80%),97.74% (1.10%) and 98.13% (1.68%) respectively.ConclusionThe method has been successfully established for quality control of Bingmei Shangqing pill.

HPLC;Wavelength switching method;Gradient elution method;Bingmei Shangqing pill;Catechin;Epicatechin;Deapio platycodin E;Platycodin E;Platycodin D3

2016-12-25

上海交通大学医学院附属同仁医院，上海200336

10.14053/j.cnki.ppcr.201709024