骨化三醇对体外培养内皮祖细胞的药理作用

余 华，朱再胜，杜晓红，张怀勤

骨化三醇对体外培养内皮祖细胞的药理作用

余 华a，朱再胜a，杜晓红a，张怀勤b

目的观察骨化三醇[1,25-(OH)2D3]干预培养对人外周血来源的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)数量及功能的影响。方法采用密度梯度离心法和差速贴壁法，获得EPCs细胞,用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜进行鉴定；然后分别加入不同浓度的骨化三醇10、50、100 μmol/L干预培养72 h，观察EPCs的数量变化、黏附、增殖和产生一氧化氮(NO)的能力。结果与对照组相比,10、50、100 μmol/L组的贴壁细胞个数分别为13.91±1.58、14.28±1.66、16.91±1.85，差异有统计学意义(P<0.01)；重贴壁细胞个数分别为9.55±1.11、10.25±1.15、10.88±1.02，差异有统计学意义(P<0.01)；增殖能力(OD值)分别为0.285±0.005、0.301±0.009、0.321±0.006，差异无统计学意义(P>0.05)；培养液中NO含量分别为5.687 9±0.392 5、5.954 7±0.243 2、7.682 2±0.353 4 μmol/L，差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨化三醇干预培养能提高人外周血来源EPCs的黏附能力，但对其增殖能力和产NO能力无明显影响。

骨化三醇；内皮祖细胞；一氧化氮；心血管疾病

0 引言

维生素D是一种人体内维持钙磷代谢平衡的重要激素，在体内经二次羟化作用后，以1,25-(OH)2D3，即骨化三醇形式发挥生物学作用[1]。由于维生素D受体同样存在内皮细胞，近年来研究发现，人体内活性维生素D不足会导致血管内皮功能障碍，且与心血管疾病的发生发展及死亡率等相关[2-3]。我们在前期临床观察发现，稳定型心绞痛患者体内维生素D浓度与外周血EPCs水平存在一定正相关性[4]。因此，我们通过本实验，进一步观察骨化三醇对体外培养EPCs数量及功能的影响,希望为维生素D防治心血管疾病的发生发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 骨化三醇标准品(纯度>99.5%)购自STEM CELL公司,人纤维连接蛋白购自Roche公司,FITC-UEA-I lectin(FITC标记的荆豆凝集Ⅰ)购自Sigma公司，DiI-ac-LDL(DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白)购自Molecular probe公司,PE-CD34单克隆抗体购自Caltag Laboratories公司，PE-VEGFR-2单克隆抗体、FITC-CD133单克隆抗体均购自R&D Systems。NO检测试剂盒购自江苏碧云天公司，CCK-8检测试剂盒购自上海同仁化学研究所,血管内皮生长因子(VEGF)购自Pepro Tech EC公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人外周血来源EPCs的培养 经我院伦理委员会批准并签署知情同意书后，从30岁健康男性志愿者的肘静脉处抽取外周血30 mL,用Hank′s液等比稀释后，小心加入在Ficoll液上面，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,按适当密度接种于24孔培养板(预先包被人纤维连接蛋白)中,每孔中加入预先混合有链霉素、青霉素、VEGF、20%胎牛血清的M199培养液，放入37 ℃、5%CO2的培养箱中培养3 d,再用Hank′s液反复冲洗2次，洗去未贴壁细胞，然后更换培养液继续培养3 d。

1.2.2 EPCs的鉴定[5]培养第6天，在显微镜下观察到贴壁的梭形细胞，用0.25%胰酶消化搜集贴壁的细胞,制成1×109/L的单细胞悬液,加入荧光标记的抗CD34、VEGFR-2及CD133单克隆抗体,用流式细胞仪分析细胞CD34、VEGFR-2及CD133表达情况。同样取培养第6天的细胞,进行双染色试验，依次加入DiI-ac-LDL、FITC-UEA-Ilectin，共同避光孵育2 h,多聚甲醛固定10 min,PBS冲洗2次后，用激光共聚焦显微镜观察鉴定细胞荧光表达情况。

1.2.3 分组 培养第6天,用0.25%胰酶将各孔细胞重新消化,制成单细胞混悬液,按1×104/cm2的密度分别接种到24孔板中,然后设立空白对照组和10、50、100 μmol/L浓度的骨化三醇干预培养组,每组设置6个复孔,继续培养72 h,再进行细胞计数、黏附、增殖及产NO能力测定。

1.2.4 EPCs的计数 在倒置相差显微镜下(上、下、左、右、中10个高倍镜视野×200)计数各组各孔具有典型梭形的贴壁细胞数。

1.2.5 EPCs的黏附能力测定 以0.25%胰酶重新消化各组各孔的贴壁细胞,制成单细胞悬液。重新接种到24孔培养板,继续培养30 min,洗去各孔未贴壁细胞,倒置相差显微镜下(上、下、左、右、中10个高倍镜视野×200)，再计数重贴壁的梭形细胞数量。

1.2.6 CCK-8法检测EPCs的增殖能力 以0.25%胰酶将每组细胞重新消化,制成单细胞悬液。再将等量细胞数重新接种到96孔培养板中,按照厂商提供的CCK-8试剂盒检测步骤，每孔加入CCK-8试剂10 μL,继续培养4 h,再以600 nm为参照波长，在酶标仪上450 nm处测吸收度A值。

1.2.7 Griess法检测EPCs分泌NO的能力 将空白组和骨化三醇干预组的细胞继续培养72 h后,各组分别吸取50 μL上清液加入96孔培养板中,按照厂商提供的步骤操作，依次加入GriessReagentⅠ、GriessReagentⅡ各50 μL,混匀后在酶标仪上570 nm处测A值。按厂商提供的步骤获取NO标准曲线(0～100 μmol/L)。

2 结果

2.1 EPCs的鉴定 根据我们实验室前期建立的培养鉴定方法[5]：培养到第3天洗去未贴壁的细胞，可以见到典型的细胞集落(图1)。培养到第6天，形成了梭形内皮样贴壁细胞。细胞表型标志检测显示其表达CD34阳性细胞比例为75.25%±7.95%、VEGFR-2阳性细胞比例为8.06%±1.28%、CD133阳性细胞比例为5.95%±1.96%。通过激光共聚焦显微镜鉴定,结合FITC-UEA-I lectin的细胞激发绿色荧光,吞噬DiI-ac-LDL的细胞激发红色荧光,双染色阳性的细胞为正在分化的EPCs(图2)。

图1 培养第3天的细胞集落(400×)

图2 细胞荧光表达结果(200×)

注：结合FITC-UEA-I lectin的细胞激发绿色荧光,吞噬DiI-ac-LDL的细胞激发红色荧光

2.2 骨化三醇对EPCs数量、黏附能力、增殖能力及产生NO能力的影响 与对照组相比，不同浓度骨化三醇组贴壁EPCs的数量均增加(P<0.01),其中100 μmol/L组与50 μmol/L、10 μmol/L组之间差异有统计学意义(P<0.01)；不同浓度的骨化三醇均可增强EPCs的黏附能力(P<0.01),但各干预组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；不同浓度的骨化三醇组对EPCs的增殖能力、产生NO能力均无明显影响(P>0.05)。见表1。

表1 骨化三醇对EPCs数量黏附增殖和产生NO能力的影响

注：*与10、50 μmol/L组比较，t=7.16、8.48，P<0.05；#与10、50 μmol/L组比较，t=2.02、1.85，P>0.05；△与10 μmol/L组比较，t=1.65，P>0.05

3 讨论

维生素D是一种类固醇激素，在人体内主要靠太阳光照产生和摄入吸收两种途径获取。以往认为维生素D仅参与人体内调节钙磷平衡代谢，但近年来其越来越多的其他生物学作用被发现[6]。国外多项流行病学研究发现，高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的血清维生素D水平降低，这种维生素D缺乏与心血管急性事件乃至死亡率存在一定相关性[3]。多项研究已经证实维生素D缺乏会导致内皮功能障碍。Pittarella等[7]研究发现，1,25-(OH)2D3可以直接作用于脐静脉内皮细胞，并通过NO途径对其迁移能力、增殖能力产生影响。Mrtínez-Miguel等[8]发现，骨化三醇可以同时上调内皮细胞合成内皮素-1和NO，二者对维持内皮细胞的功能平衡具有重要作用。

人外周血中的EPCs是一类内皮前体细胞，称为循环EPCs[9]，由骨髓动员进入外周血，细胞表型主要以CD34阳性为主，可以归巢到血管损伤部位，能够分化为成熟血管内皮细胞，具有促进损伤区域血管新生和修复损伤血管内膜的作用，同时具有旁分泌功能，能分泌VEGF-A、成纤维细胞因子-2等，对内皮功能具有重要的修复及保护作用，因此，在冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压等心血管疾病的发生发展过程中具有重要的保护作用[10]。鉴于骨化三醇、EPCs在内皮功能上存在交叉点，因此，有学者开始探索研究骨化三醇与EPCs之间的直接关联性。

Cianciolo等[11]证实，维生素D受体同样存在于外周血循环EPCs上，通过对入选透析患者做补充活性维生素D治疗后，可以增加循环EPCs的数量。Brodowski等[12]对子痫前期的孕妇适当给予补充维生素D后，其体内的内皮祖细胞功能得到改善。本实验也进一步证实，骨化三醇可以直接提高体外培养的人外周血来源的EPCs的黏附能力；虽然各浓度组EPCs的增殖能力略受影响，但与对照组比较，差异无统计学意义；本实验未能进一步证实骨化三醇可以提高EPCs产NO的能力，提示骨化三醇在对EPCs的生物学功能影响不一定是通过NO实现的。

目前已经证实，维生素D受体广泛存在于各类组织细胞和上皮细胞上，分为细胞核受体和细胞膜受体两大类，是骨化三醇发挥生物学作用的主要受体[13]。维生素D受体存在于人体各类组织细胞和内皮细胞[14]。在Cianciolo等[11]的研究基础上，我们推测骨化三醇通过作用于EPCs的维生素D受体后，激活某种细胞信号转导通路，并对EPCs的增殖、分化及旁分泌等功能产生影响。我们的后期实验也将进一步探讨该机制。综合本实验结果，由于人体内的活性维生素D的浓度远小于100 μmol/L[15]，因此，我们推测骨化三醇对体内EPCs的作用有限，可能只是促进外周循环EPCs的归巢作用，而本身对EPCs的功能影响较小，这仍需要更多的实验数据来进一步证实。我们期望通过本实验研究，使补充维生素D成为防治心血管疾病的有益补充。

[1] Christakos S,Dhawan P,Verstuyf A,et al.Vitamin D:metabolism,molecular mechanism of action,and pleiotropic effects[J].Physiol Rev,2016,96(1):365-408.

[2] Skaaby T.The relationship of vitamin D status to risk of cardiovascular disease and mortality[J].Dan Med J,2015,62(2):B5008.

[3] Beveridge LA,Struthers AD,Khan F,et al.Effect of vitamin D supplementation on blood pressure:a systematic review and meta-analysis incorporating individual patient data[J].JAMA Intern Med,2015,175(5):745-754.

[4] 余华,肖方毅,张怀勤,等.稳定型心绞痛患者的血维生素D浓度和循环内皮祖细胞的关系[J].医学研究杂志,2012,41(11):154-158.

[5] 贾红梅,张怀勤,夏雪,等.非对称性二甲基精氨酸通过Caspase-3信号转导通路诱导晚期内皮祖细胞凋亡[J].中国动脉硬化杂志,2010,18(6):369-372.

[6] Berridge MJ.Vitamin D:a custodian of cell signalling stability in health and disease[J].Biochem Soc Trans,2015,43(3):349-358.

[7] Pittarella P,Squarzanti DF,Molinari C,et al.NO-dependent proliferation and migration induced by Vitamin D in HUVEC[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2015,149:35-42.

[8] Martínez-Miguel P,Valdivielso JM,Medrano-Andrés D,et al.The active form of vitamin D,calcitriol,induces a complex dual upregulation of endothelin and nitric oxide in cultured endothelial cells[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2014,307(12):E1085-E1096.

[9] Madonna R,De Caterina R.Circulating endothelial progenitor cells:do they live up to their name[J].Vascul Pharmacol,2015,67-69:2-5.

[10]King TF,McDermott JH.Endothelial progenitor cells and cardiovascular disease[J].J Stem Cells,2014,9(2):93-106.

[11]Cianciolo G,La Manna G,Cappuccilli ML,et al.VDR expression on circulating endothelial progenitor cells in dialysis patients is modulated by 25(OH)D serum levels and calcitriol therapy[J].Blood Purif,2011,32(3):161-173.

[12]Brodowski L,Burlakov J,Myerski AC,et al.Vitamin D prevents endothelial progenitor cell dysfunction induced by sera from women with preeclampsia or conditioned media from hypoxic placenta[J].PLoS One,2014,9(6):e98527.

[13]Carlberg C,Molnár F.Vitamin dreceptor signaling and its therapeutic implications:genome-wide and structural view[J].Can J Physiol Pharmacol,2015,93(5):311-318.

[14]Lucock M,Jones P,Martin C,et al.Vitamin D:beyond metabolism[J].J Evid Based Complementary Altern Med,2015,20(4):310-322.

[15]Muscogiuri G,Altieri B,Penna-Martinez M,et al.Focus on vitamin D and the adrenal gland[J].Horm Metab Res,2015,47(4):239-246.

Pharmacologicaleffectsofcalcitriolonendothelialprogenitorcellsinvitro

YU Huaa,ZHU Zai-shenga,DU Xiao-honga,ZHANG Huai-qinb

(a.Department of Geriatric Medicine,b.Department of Cardiovascular Medicine,First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China)

ObjectiveTo observe the effect of calcitriol [1,25-(OH)2D3] on the number and function of endothelial progenitor cells (EPCs) in human peripheral blood.MethodsEPCs were obtained by Ficoll density gradient centrifugation and differential adherence method,and identified by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy.Then,the attached cells were stimulated with calciriol (10,50 and 100 μmol/L) for 72 h.The number of EPCs,adhesion,proliferation,and production of nitric oxide (NO) were observed.ResultsCompared with control group,the number of attached cells in 10,50 and 100 μmol/L groups were 13.91±1.58,14.28±1.66,and 16.91±1.85,respectively,the difference being statistically significant (P<0.01);the number of reattached cells were 9.55±1.11,10.25±1.15 and 10.88±1.02,respectively,the difference being statistically significant (P<0.01);proliferation (OD value) were 0.285±0.005,0.301±0.009 and 0.321±0.006,respectively,and there was no statistically significant difference (P>0.05);the NO content in culture medium was 5.687 9±0.392 5,5.954 7±0.243 2 and 7.682 2±0.353 4 μmol/L,respectively,there being no statistically significant difference (P>0.05).ConclusionCalcitriol can improve adhesive ability of EPCs,but has no effect on either proliferation or secretion of NO in EPCsinvitro.

Calcitriol;Endothelial progenitor cells;Nitric oxide;Cardiovascular disease

2016-03-22

温州医科大学附属第一医院a.干部保健科，b.心内科，温州 325000

温州市科技局基金项目(Y20120141)

10.14053/j.cnki.ppcr.201709002