氯胺酮预处理对卵蛋白激活的致敏大鼠肺泡巨噬细胞丙二醛及超氧化物歧化酶的影响

闫 芳,谢啟发,马炳原,刘 顺,朱蓉蓉,韩小飞,张小宝

·论著·

氯胺酮预处理对卵蛋白激活的致敏大鼠肺泡巨噬细胞丙二醛及超氧化物歧化酶的影响

闫 芳1,谢啟发1,马炳原1,刘 顺1,朱蓉蓉1,韩小飞1,张小宝2*

目的研究不同剂量氯胺酮对卵蛋白(OVA)刺激致敏的大鼠肺泡巨噬细胞丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的影响。方法致敏的大鼠肺泡巨噬细胞分离培养,氯胺酮(10、100、1 000 μmol/L)预处理后给予OVA刺激,培养72 h后检测细胞培养上清液中MDA及SOD水平。结果与对照组比较,OVA组培养上清液中MDA水平明显增加,伴有SOD水平下降,而较高浓度氯胺酮预处理(100、1 000 μmol/L)后可起到一定的抑制作用。结论氯胺酮预处理对OVA引起的肺泡巨噬细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用。

氯胺酮;卵蛋白;肺泡巨噬细胞;丙二醛;超氧化物歧化酶

0 引言

氧化应激是哮喘的病理机制之一,同时伴有炎症反应、氧自由基增多、免疫损伤等,造成抗氧化作用失调。作为主要免疫效应细胞的巨噬细胞可通过分泌多种炎症反应细胞因子、补体、趋化因子等,对炎症反应起到重要的作用，通过影响细胞因子的表达降低组织的炎症反应。

氯胺酮作为临床上儿童麻醉常用的静脉麻醉药品,在镇静的同时还具有一定的抗炎和支气管舒张作用,可明显降低巨噬细胞TNF-β、IL-6等炎性因子的释放[1-3],但是氯胺酮对哮喘细胞模型中巨噬细胞氧化应激的影响尚未见相关报道。因此,本研究拟探讨氯胺酮预处理对卵蛋白(OVA)引起的氧化应激的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF级SD大鼠(南京医科大学实验动物中心),体重250 g左右。鸡卵蛋白(V级,Sigma,美国)。盐酸氯胺酮粉末(KET,批号:05051112,江苏恒瑞医药公司)。超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)试剂盒(南京市建成生物工程研究所)。胎牛血清(杭州市四季青公司)、全自动酶标检测仪(Sunrise,澳大利亚)、RPMI-1640培养液(美国Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 大鼠分别于第1天和第7天胸部皮下注射1 mL内含卵蛋白1 mg的PBS液和Al(OH)3100 mg,第21天用50 mg/kg戊巴比妥钠于大鼠腹腔内注射,麻醉后切开气管,插入预制的聚乙烯导管行支气管肺泡灌洗[4],用预冷的PBS 20 mL分5次灌洗大鼠双肺后回收灌洗液,高速离心后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬,洗涤后加入RPMI-1640培养液,然后均匀接种于预温的培养板上,培养2 h后更换细胞培养液,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中继续培养。

1.2.2 培养上清液中SOD及MDA的检测 将分离出的肺泡巨噬细胞按5×106个/mL密度接种于24孔板上,2 mL/孔。24 h后换液,细胞分为5组。对照组(C组):实验后于培养液中加入预温的PBS;OVA组(O组):于培养液中加入100 μg/mL的OVA对巨噬细胞进行刺激;低、中、高浓度氯胺酮组(K1～K3组):于细胞培养液中加入预先配置的氯胺酮(终浓度分别为10、100、1 000 μmol/L),共同培养0.5 h后,再加入OVA刺激。72 h后分离各组的上层培养液,1 200 r/min离心后取上清液,置于-20 ℃冰箱待测。上清液按试剂盒说明书进行检测。

2 结果

氯胺酮对大鼠肺泡巨噬细胞培养上清液中MDA及SOD的影响：与C组比较,O组刺激后SOD的活性显著降低,而MDA含量显著升高(P<0.05)。与O组比较,K1组MDA含量和SOD活性差异无统计学意义;与O组比较,K2组、K3组的MDA含量降低,SOD活性升高(P<0.01)。见表1。

表1 细胞培养液上清液中SOD活性及MDA含量

注：与C组比较,*P<0.05,**P<0.01;与O组比较,##P<0.01

3 讨论

OVA可激活肺泡巨噬细胞产生氧化应激反应,氯胺酮预先给药可抑制肺泡巨噬细胞MDA的升高,同时提高SOD的水平。氯胺酮是临床上常用的麻醉药品,研究显示,氯胺酮具有一定的抗炎作用,可以抑制内皮细胞HMGB-1的分泌,从而起到细胞保护作用[4]。在兼具抗炎作用的同时,氯胺酮也有一定的支气管舒张作用,其机制可能与激活BKCa和PKG信号通路有关[5]。

作为气道炎症的主要始动细胞,肺泡巨噬细胞是最早接触外界抗原类物质和病原微生物的细胞[6]。当巨噬细胞被病原微生物刺激后,巨噬细胞可通过呼吸爆发产生大量的氧自由基,不仅消灭病原微生物,而且对肺内其他细胞也可能产生一定的损伤[7]。其损伤的程度可以用氧化应激的指标来反映。MDA是氧化应激的产物之一,MDA的增加可导致细胞膜的损坏;作为抗氧化酶,SOD具有清除自由基和抑制过氧化反应的功能。因此,检测MDA和SOD水平可以反映细胞内的氧化应激水平,从而了解细胞的损伤程度。

肺泡巨噬细胞内模拟氧化损伤的常用药物为OVA[8]。Rainer等[9]发现,OVA可致敏小型猪的肺泡巨噬细胞,当用100 μg/mL OVA再次刺激时，其淋巴细胞的趋化性显著增高。用20～200 μg的OVA刺激肝脏巨噬细胞，可引起肝细胞H2O2显著升高[10]。

本实验中OVA激发可明显降低SOD水平,同时增加MDA水平,对巨噬细胞产生毒性。而氯胺酮可在转录水平抑制细胞的炎性反应[11],从而起到细胞保护作用。本实验选用3个倍增终浓度(10、100、1 000 μmol/L)的氯胺酮进行预处理,未发现氯胺酮对细胞的死亡率有影响,因此排除了氯胺酮对细胞产生毒性作用。同时,结果显示,较高浓度的氯胺酮可抑制OVA刺激的致敏巨噬细胞MDA升高及SOD下降,其抑制效果不具有浓度依赖性。

综上所述,氯胺酮可抑制OVA引起的致敏大鼠肺泡巨噬细胞氧化应激反应,从而对巨噬细胞产生一定的保护作用。

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Effectsofketaminepretreatmentonmalondialdehyde(MDA)andsuperoxidedismutase(SOD)inalveolarmacrophagesofratssensitizedbyovalbumin

YAN Fang1,XIE Qi-fa1,MA Bing-yuan1,LIU Shun1,ZHU Rong-rong1,HAN Xiao-fei1,ZHANG Xiao-bao2*

(1.Department of Basic Medical Science,Kangda College of Nanjing Medical University,Lianyungang 222000,China;2. Department of Anesthesiology,Lianyungang No.1 Hospital,Lianyungang 222000,China)

ObjectiveTo study the effects of different doses of ketamine on malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in alveolar macrophages of rats sensitized by ovalbumin (OVA).MethodsAlveolar macrophages were isolated and cultured,and pretreated with ketamine at concentration of 10,100 and 1 000 μmol/L,then challenged with OVA.After being cultured for 72 h,the production of SOD and MDA in the supernatant of macrophage was assayed.ResultsCompared with control group,the MDA level in culture supernatants of OVA group was significantly increased with the decreased level of SOD,while higher concentration of ketamine (100 and 1 000 μmol/L) pretreatment could inhibit this response.ConclusionKetamine pretreatment exerts a protective effects on OVA-induced oxidative stress injury of alveolar macrophage.

Ketamine;Ovalbumin (OVA);Alveolar macrophage;Malondialdehyde;Superoxide dismutase

2017-01-17

1.南京医科大学康达学院基础医学部,连云港 222000; 2.连云港市第一人民医院麻醉科,连云港 222000

连云港市科技局课题(SH1402)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201709001